Использование внутреннего контрольного образца на основе рекомбинантных ретровирусных частиц для повышения достоверности ПЦР-исследования

Широкое внедрение методов обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в биологию и медицину для исследования вирусных и клеточных молекул РНК предполагает получение стабильных, хорошо охарактеризованных контролей и стандартов. Разработан новый тип внутреннего контрольного образца (ВКО) на основе рекомбинантных ретровирусных частиц для оценки эффективности выделения генетического материала и количественных параметров реакций ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Препарат включает следующие компоненты: генетически модифицированные вирионы, в геном которых клонирован ген-мишень, набор праймеров и гибридизационную пробу для его детекции. В составе рекомбинантных ретровирусов как своеобразных имитаторов природного вируса РНК защищена белковой оболочкой и устойчива к действию рибонуклеаз. Наличие контроля в каждой отдельной пробе биологического материала позволяет максимально точно учесть все факторы, влияющие на молекулу РНК в процессе исследования. Благодаря использованию такого препарата в качестве ВКО появляется возможность контролировать процессы выделения и сохранности РНК, отдельные стадии реакции обратной транскрипции и ПЦР, оценить влияние ингибиторов, содержащихся в биологических жидкостях, на ферменты реакций ОТ-ПЦР, сравнивать образцы между собой, что повышает достоверность исследования и позволяет исключить появление ложноотрицательных результатов.

1. Нетесов, С. В. Сравнительная оценка современных методов диагностики вирусных инфекций / С. В. Нетесов, Н. А. Маркевич // Молекул. медицина. – 2008. – № 5. – С. 41–47.

2. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing / M. J. Espy [et al.] // Clin. Microbiol. Rev. – 2006. – Vol. 19, N 1. – P. 165–256. https://doi.org/10.1128/cmr.19.1.165-256.2006

3. Real-time RT-PCR normalization; strategies and considerations / J. Huggett [et al.] // Genes Immun. – 2005. – Vol. 6, N 4. – P. 279–284. https://doi.org/10.1038/sj.gene.6364190

4. Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции / Т. Е. Сизикова [и др.] // Клин. лаб. диагностика. – 2013. – № 3. – С. 41–44.

5. Niesters, H. G. M. Molecular and diagnostic clinical virology in real time / H. G. M. Niesters // Clin. Microbiol. Infect. – 2004. – Vol. 10, N 1. – P. 5–11. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2004.00699.x

6. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR / J. Hoorfar [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol. 42, N 5. – P. 1863–1868. https://doi.org/10.1128/jcm.42.5.1863-1868.2004

7. Felder, E. Development of a versatile and stable internal control system for RT-qPCR assays / E. Felder, R. Wölfel // J. Virol. Meth. – 2014. – Vol. 208. – P. 33–40. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2014.07.028

8. Strategic approach to produce low-cost, efficient, and stable competitive internal controls for detection of RNA viruses by use of reverse transcription-PCR / G. V. Villanova [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2007. – Vol. 45, N 11. – P. 3555– 3563. https://doi.org/10.1128/jcm.02601-06

9. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR / K. Dheda [et al.] // BioTechniques. – 2004. – Vol. 37, N 1. – P. 112–119. https://doi.org/10.2144/04371rr03

10. Schmittgen, T. D. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR / T. D. Schmittgen, B. A. Zakrajsek // J. Biochem. Biophys. Meth. – 2000. – Vol. 46, N 1–2. – P. 69–81. https://doi.org/10.1016/s0165-022x(00)00129-9

11. Hazari, S. Development and evaluation of a quantitative competitive reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for hepatitis C virus RNA in serum using transcribed thio-RNA as internal control / S. Hazari, S. K. Acharya, S. K. Panda // J. Virol. Meth. – 2004. – Vol. 116, N 1. – P. 45–54.

12. Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards / B. L. Pasloske [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1998. – Vol. 36, N 12. – P. 3590–3594.

13. Donia, D. Use of armored RNA as a standard to construct a calibration curve for real-time RT-PCR / D. Donia, M. Divizia, A. Pana // J. Virol. Meth. – 2005. – Vol. 126, N 1–2. – P. 157–163. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.02.004

14. Stevenson, J. The use of armored RNA as a multi-purpose internal control for RT-PCR / J. Stevenson, W. Hymas, D. Hillyard // J. Virol. Meth. – 2008. – Vol. 150, N 1–2. – P. 73–76. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2008.02.007

15. Векторная конструкция для накопления армированной РНК / В. А. Землянский [и др.] // Вес. НАН Беларусi. Сер. мед. навук. – 2015. – № 2. – С. 19–22.

16. Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics / M. R. Zambenedetti [et al.] // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. – 2017. – Vol. 112, N 5. – P. 339–347. https://doi.org/10.1590/007402760160380

17. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual : in 3 vol. / J. Sambrook, D. W. Russell. – 3rd ed. – New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. – Vol. 1. – 749 p.

18. Markowitz, D. Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line / D. Markowitz, S. Goff, A. Bank // Virology. – 1988. – Vol. 167, N 2. – P. 400–406. https://doi.org/10.1016/0042-6822(88)90101-8

19. The U3 region of Moloney murine leukemia virus contains position-independent cis-acting sequences involved in the nuclear export of full-length viral transcripts / N. Volkova [et al.] / J. Biol. Chem. – 2014. – Vol. 289, N 29. – Р. 20158–20169. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.545855

20. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии / О. В. Степаненко [и др.] // Цитология. – 2007. – Т. 49, № 5. – С. 395–420.

21. Differential rates of gene expression monitored by green fluorescent protein / C. Lu [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2002. – Vol. 79, N 4. – P. 429–437. https://doi.org/10.1002/bit.10295