vestibИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Biological Series1029-89402524-230XThe Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1029-8940-2019-64-4-420-430vestib-504Research ArticleСтатьиИспользование внутреннего контрольного образца на основе рекомбинантных ретровирусных частиц для повышения достоверности ПЦР-исследованияApplication of internal control based on recombinant retroviral particles for increasing the PCR assay reliabilityФоминаЕ. Г.FominaE. G.

Фомина Елена Георгиевна – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Elena G. Fomina – Ph. D. (Biol.), Leading researcher

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

feg1@tut.byГригорьеваЕ. Е.GrigorievaE. E.

Григорьева Елена Евгеньевна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Elena E. Grigorieva – Ph. D. (Biol.), Senior researcher

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

grigus@mail.ruСчесленокЕ. П.ScheslenokE. P.

Счесленок Елена Павловна – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Elena P. Scheslenok – Ph. D. (Biol.), Leading researcher

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

СемижонП. А.SemizhonP. A.

Семижон Павел Анатольевич – кандидат биологических наук, заведующий лабораторией

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Pavel A. Semizhon – Ph. D. (Biol.), Head of the Laboratory

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

ТкачевС. В.TkachevS. V.

Ткачев Сергей Викторович – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Sergey V. Tkachev – Ph. D. (Biol.), Leading researcher

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

ВладыкоА. С.VladykoA. S.

Владыко Александр Станиславович – доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Alexander S. Vladyko – D. Sc. (Med.), Professor, Chief researcher

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологииRepublican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology201907112019644420430Copyright © Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е., Счесленок Е.П., Семижон П.А., Ткачев С.В., Владыко А.С., 20192019Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е., Счесленок Е.П., Семижон П.А., Ткачев С.В., Владыко А.С.Fomina E.G., Grigorieva E.E., Scheslenok E.P., Semizhon P.A., Tkachev S.V., Vladyko A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestibio.belnauka.by/jour/article/view/504

Широкое внедрение методов обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в биологию и медицину для исследования вирусных и клеточных молекул РНК предполагает получение стабильных, хорошо охарактеризованных контролей и стандартов. Разработан новый тип внутреннего контрольного образца (ВКО) на основе рекомбинантных ретровирусных частиц для оценки эффективности выделения генетического материала и количественных параметров реакций ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Препарат включает следующие компоненты: генетически модифицированные вирионы, в геном которых клонирован ген-мишень, набор праймеров и гибридизационную пробу для его детекции. В составе рекомбинантных ретровирусов как своеобразных имитаторов природного вируса РНК защищена белковой оболочкой и устойчива к действию рибонуклеаз. Наличие контроля в каждой отдельной пробе биологического материала позволяет максимально точно учесть все факторы, влияющие на молекулу РНК в процессе исследования. Благодаря использованию такого препарата в качестве ВКО появляется возможность контролировать процессы выделения и сохранности РНК, отдельные стадии реакции обратной транскрипции и ПЦР, оценить влияние ингибиторов, содержащихся в биологических жидкостях, на ферменты реакций ОТ-ПЦР, сравнивать образцы между собой, что повышает достоверность исследования и позволяет исключить появление ложноотрицательных результатов.

Molecular diagnostic tests based on PCR preceded by reverse transcription (RT-PCR) are now used commonly for the detection of viral pathogens with RNA genomes. The application of internal controls to validate the entire process of these assays is necessary to prevent false-negative results caused by inhibition or inefficient extraction. In the present study a strategy to produce a new type of internal control for RT-PCR based on recombinant retroviral particles is described. Cell clones stably producing retroviral particles were established by transfecting GP+env-AM12 packaging cells with constructed MoMuLV-derived retroviral vector pLneo/gfp and subsequent cultivation on selective medium with G418. The egfp gene was used as a target for primers and hybridization probe design for real-time RT-PCR assay and as a marker for flow cytometry analysis of eGFP expression by transfected cells. The developed internal control is stable and ribonuclease resistant, economical to produce, noninfectious and safe for routine use. It closely mimics the natural virus and could be successfully used to monitor all the stages of RT-PCR, including nucleic acid extraction, RNA reverse transcription and amplification.

диагностикаОТ-ПЦР с детекцией продуктов реакции в режиме реального временивнутренний контрольный образецРНК-вирусыРНК-стандартdiagnosticsreal time PCRRNA virusesinternal controlretroviral particlesReferencesНетесов, С. В. Сравнительная оценка современных методов диагностики вирусных инфекций / С. В. Нетесов, Н. А. Маркевич // Молекул. медицина. – 2008. – № 5. – С. 41–47.Netesov S. V., Markevich N. A. Comparative evaluation of modern methods for viral infections diagnostics. Molekulyarnaya medicina [Molecular medicine], 2008, no. 5, pp. 41–47 (in Russian).Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing / M. J. Espy [et al.] // Clin. Microbiol. Rev. – 2006. – Vol. 19, N 1. – P. 165–256. https://doi.org/10.1128/cmr.19.1.165-256.2006Espy M., Uhl J., Sloan L., Buckwalter S., Jones M., Vetter E. [et al.]. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clinical Microbiology Reviews, 2006, vol. 19, no. 1, pp. 165–256. https://doi.org/10.1128/cmr.19.1.165-256.2006Real-time RT-PCR normalization; strategies and considerations / J. Huggett [et al.] // Genes Immun. – 2005. – Vol. 6, N 4. – P. 279–284. https://doi.org/10.1038/sj.gene.6364190Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. Real-time RT-PCR normalization; strategies and considerations. Genes and Immunity, 2005, vol. 6, no. 4, pp. 279–284. https://doi.org/10.1038/sj.gene.6364190Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции / Т. Е. Сизикова [и др.] // Клин. лаб. диагностика. – 2013. – № 3. – С. 41–44.Sizikova T. E., Mel’nikova E. V., Manoshkin A. V., Petrov A. A., Mel’nikov D. G., Pantyukhov V. B., Lebedev V. N., Borisevich S. V. The application of external and internal control objects in case of using of polymerase chain reaction and reverse transcription polymerase chain reaction. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika [Clinical laboratory diagnostics], 2013, no. 3, pp. 41–44 (in Russian).Niesters, H. G. M. Molecular and diagnostic clinical virology in real time / H. G. M. Niesters // Clin. Microbiol. Infect. – 2004. – Vol. 10, N 1. – P. 5–11. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2004.00699.xNiesters H. G. M. Molecular and diagnostic clinical virology in real time. Clinical Microbiology and Infection, 2004, vol. 10, no. 1, pp. 5–11. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2004.00699.xPractical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR / J. Hoorfar [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol. 42, N 5. – P. 1863–1868. https://doi.org/10.1128/jcm.42.5.1863-1868.2004Hoorfar J., Malorny B., Abdulmawjood A., Cook N., Wagner M., Fach P. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR. Journal of Clinical Microbiology, 2004, vol. 42, no. 5, pp. 1863–1868. https://doi.org/10.1128/jcm.42.5.1863-1868.2004Felder, E. Development of a versatile and stable internal control system for RT-qPCR assays / E. Felder, R. Wölfel // J. Virol. Meth. – 2014. – Vol. 208. – P. 33–40. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2014.07.028Felder E., Wölfel R. Development of a versatile and stable internal control system for RT-qPCR assays. Journal of Virological Methods, 2014, vol. 208, pp. 33–40. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2014.07.028Strategic approach to produce low-cost, efficient, and stable competitive internal controls for detection of RNA viruses by use of reverse transcription-PCR / G. V. Villanova [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2007. – Vol. 45, N 11. – P. 3555– 3563. https://doi.org/10.1128/jcm.02601-06Villanova G. V., Gardiol D., Taborda M. A., Reggiardo V., Tanno H., Rivadeneira E. D., Perez G. R., Giri A. A. Strategic approach to produce low-cost, efficient, and stable competitive internal controls for detection of RNA viruses by use of reverse transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology, 2007, vol. 45, no. 11, pp. 3555–3563. https://doi.org/10.1128/jcm.02601-06Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR / K. Dheda [et al.] // BioTechniques. – 2004. – Vol. 37, N 1. – P. 112–119. https://doi.org/10.2144/04371rr03Dheda K., Huggett J. F., Bustin S. A., Johnson M. A., Rook G., Zumla A. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. BioTechniques, 2004, vol. 37, no. 1, pp. 112–119. https://doi.org/10.2144/04371rr03Schmittgen, T. D. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR / T. D. Schmittgen, B. A. Zakrajsek // J. Biochem. Biophys. Meth. – 2000. – Vol. 46, N 1–2. – P. 69–81. https://doi.org/10.1016/s0165-022x(00)00129-9Schmittgen T. D., Zakrajsek B. A. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2000, vol. 46, no. 1–2, pp. 69–81. https://doi.org/10.1016/s0165-022x(00)00129-9Hazari, S. Development and evaluation of a quantitative competitive reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for hepatitis C virus RNA in serum using transcribed thio-RNA as internal control / S. Hazari, S. K. Acharya, S. K. Panda // J. Virol. Meth. – 2004. – Vol. 116, N 1. – P. 45–54.Hazari S., Acharya S. K., Panda S. K. Development and evaluation of a quantitative competitive reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for hepatitis C virus RNA in serum using transcribed thio-RNA as internal control. Journal of Virological Methods, 2004, vol. 116, no. 1, pp. 45–54.Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards / B. L. Pasloske [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1998. – Vol. 36, N 12. – P. 3590–3594.Pasloske B. L., Walkerpeach C. R., Obermoeller R. D., Winkler M., DuBois D. B. Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards. Journal of Clinical Microbiology, 1998, vol. 36, no. 12, pp. 3590–3594.Donia, D. Use of armored RNA as a standard to construct a calibration curve for real-time RT-PCR / D. Donia, M. Divizia, A. Pana // J. Virol. Meth. – 2005. – Vol. 126, N 1–2. – P. 157–163. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.02.004Donia D., Divizia M., Pana A. Use of armored RNA as a standard to construct a calibration curve for real-time RTPCR. Journal of Virological Methods, 2005, vol. 126, no. 1–2, pp. 157–163. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.02.004Stevenson, J. The use of armored RNA as a multi-purpose internal control for RT-PCR / J. Stevenson, W. Hymas, D. Hillyard // J. Virol. Meth. – 2008. – Vol. 150, N 1–2. – P. 73–76. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2008.02.007Stevenson J., Hymas W., Hillyard D. The use of armored RNA as a multi-purpose internal control for RT-PCR. Journal of Virological Methods, 2008, vol. 150, no. 1–2, pp. 73–76. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2008.02.007Векторная конструкция для накопления армированной РНК / В. А. Землянский [и др.] // Вес. НАН Беларусi. Сер. мед. навук. – 2015. – № 2. – С. 19–22.Zemlyanskii V. A., Dedyulya K. L., Poklonskaya N. V., Amvros’eva T. V. Vector construction for production of armored nucleic acid. Vestsi Natsyyanal’nai akademii navuk Belarusi. Seriya medytsynskikh navuk = Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus. Medicine series, 2015, no. 2, pp. 19–22 (in Russian).Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics / M. R. Zambenedetti [et al.] // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. – 2017. – Vol. 112, N 5. – P. 339–347. https://doi.org/10.1590/007402760160380Zambenedetti M. R., Pavoni D. P., Dallabona A. C., Dominguez A. C., Poersch C., Fragoso S. P., Krieger M. A. Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 2017, vol. 112, no. 5, pp. 339–347. https://doi.org/10.1590/0074-02760160380Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual : in 3 vol. / J. Sambrook, D. W. Russell. – 3rd ed. – New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. – Vol. 1. – 749 p.Sambrook J., Russell D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. Vol. 1. N ew York, C old S pring Harbor Laboratory Press, 2001. 749 p.Markowitz, D. Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line / D. Markowitz, S. Goff, A. Bank // Virology. – 1988. – Vol. 167, N 2. – P. 400–406. https://doi.org/10.1016/0042-6822(88)90101-8Markowitz D., Goff S., Bank A. Construction and use of a safe and efficient amphotropic packaging cell line. Virology, 1988, vol. 167, no. 2, pp. 400–406. https://doi.org/10.1016/0042-6822(88)90101-8The U3 region of Moloney murine leukemia virus contains position-independent cis-acting sequences involved in the nuclear export of full-length viral transcripts / N. Volkova [et al.] / J. Biol. Chem. – 2014. – Vol. 289, N 29. – Р. 20158–20169. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.545855Volkova N. A., Fomina E. G., Smolnikova V. V., Zinovieva N. A., Fomin I. K. The U3 region of Moloney murine leukemia virus contains position-independent cis-acting sequences involved in the nuclear export of full-length viral transcripts. Journal of Biological Chemistry, 2014, vol. 289, no. 29, pp. 20158–20169. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.545855Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии / О. В. Степаненко [и др.] // Цитология. – 2007. – Т. 49, № 5. – С. 395–420.Stepanenko O. V., Verkhusha V. V., Kuznetsova I. M., Turoverov K. K. Fluorescent proteins: physical-chemical properties and application in cell biology. Tsitologiya [Cytology], 2007, vol. 49, no. 5, pp. 395–420 (in Russian).Differential rates of gene expression monitored by green fluorescent protein / C. Lu [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2002. – Vol. 79, N 4. – P. 429–437. https://doi.org/10.1002/bit.10295Lu C., Albano C. R., Bentley W. E., Rao G. Differential rates of gene expression monitored by green fluorescent protein. Biotechnology and Bioengineering, 2002, vol. 79, no. 4, pp. 429–437. https://doi.org/10.1002/bit.10295

The authors declare that there are no conflicts of interest present.