Получение рекомбинантного белка человеческого фактора некроза опухоли-альфа в клет- ках бактерий Escherichia coli и оценка его биологической активности

В работе представлены ключевые стадии получения субстанции рекомбинантного человеческого фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) в клетках бактерий Escherichia coli. Описаны этапы конструирования нук- леотидной последовательности и клонирование гена в составе вектора pET24b(+) под промотором бактериофага Т7. Сконструирован потенциальный штамм-продуцент рекомбинантного белка на основе E. coli BL21-Gold(DE3), способный к наработке растворимой формы ФНО-α в количестве, превышающем 30 % от общего белка клетки. Осуществлена очистка целевого белка с использованием тандемной ионообменной и эксклюзионной хроматографий. Определена биологическая активность полученного образца в рамках стандартного протокола производства биомедицинских клеточных продуктов на основе дендритных клеток (ДК). Установлена жизнеспособность ДК, достоверно не отличающаяся в контрольной и опытной группах и превышающая 90 %. Вместе с тем образец ФНО-α характеризуется усилением экспрессии молекул-маркеров зрелых ДК CD83 и HLA-DR. Полученные данные свидетельствуют о высокой иммунобиологической активности в сравнении с доступным коммерческим препаратом, а также о потенциальной возможности импортозамещения.

1. . Transmembrane TNF-a: structure, function and interaction with anti-TNF agents / T. Horiuchi, H. Mitoma, S. Harashima [et al.] // Rheumatology. – 2010. – Vol. 49, N 7. – P. 1215–1228. https://doi.org/10.1093/rheumatology/keq031

2. Eck, M. J. The Structure of Tumor Necrosis Factor-α at 2.6 Å Resolution / M. J. Eck, S. R. Sprang // Journal of Biological Chemistry. – 1989. – Vol. 264, N 29. – P. 17595–17605. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)71533-0

3. A Domain in TNF Receptors That Mediates Ligand-Independent Receptor Assembly and Signaling / F. K. M. Chan, H. J. Chun, L. Zheng [et al.] // Science. – 2000. – Vol. 288, N 5475. – P. 2351–2354. https://doi.org/10.1126/science.288.5475.2351

4. Chu, W. M. Tumor necrosis factor / W. M. Chu // Cancer Letters. – 2013. – Vol. 328, N 2. – P. 222–225. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2012.10.014

5. Stability Program in Dendritic Cell Vaccines: A “Real-World” Experience in the Immuno-Gene Therapy Factory of Romagna Cancer Center / E. Pancisi, A. M. Granato, E. Scarpi [et al.] // Vaccines. – 2022. – Vol. 10, N 7. – Art. 999. https:// doi.org/10.3390/vaccines10070999 Proceedings of the National Academy of S

6. Advanced therapy medicinal products: current and future perspectives / Е. Hanna, C. Rémuzat, P. Auquier, M. Toumi // Journal of Market Access and Health Policy. – 2016. – Vol. 4, N 1. – Art. 31036. https://doi.org/10.3402/jmahp.v4.31036

7. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1977. – Vol. 74, N 12. – P. 5463–5467. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463

8. Current protocols in molecular biology / eds.: F. M. Ausbel, R. Brent, R. E. Kingston [et al.]. – New York: John Wiley & Sons, 2003. – 4648 p.

9. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, N 5259. – P. 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0

10. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server / E. Gasteiger, Ch. Hoogland, A. Gattiker [et al.] // The Proteomics Protocols Handbook / ed. J. M. Walker. – Totowa, NJ, 2005. – P. 571–607. https://doi.org/10.1385/1-59259890-0:571

11. Burland, T. G. DNASTAR’s Lasergene Sequence Analysis Software / T. G. Burland // Bioinformatics Methods and Protocols / eds.: S. Misener, S. A. Krawetz. – Totowa, NJ, 1999. – Vol. 132. – P. 71–91. https://doi.org/10.1385/1-59259-192-2:71

12. Peden, J. F. Analysis of Codon Usage: diss. … for the degree of Dr. of Philosophy / John F. Peden; University of Nottingham. – Nottingham, 2000. – 215 p.

13. Shneider, C. A. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis / C. A. Shneider, W. S Rasband, K. W. Eliceiri // Nature Methods. – 2012. – Vol. 9, N 7. – P. 671–675. https://doi.org/10.1038/nmeth.2089

14. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry / M. Gassman, B. Grenacher, B. Rohde, J. Vogel // Electrophoresis. – 2009. – Vol. 30, N 11. – P. 1845–1855. https://doi.org/10.1002/elps.200800720

15. Характеристика дендритных клеток для иммунотерапии рака поджелудочной железы / А. Е. Гончаров, И. В. Романов, И. В. Залуцкий [и др.] // Известия Нациаональной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. – 2014. – № 2. – С. 4–12.

16. Иммунофенотип и функциональные свойства моноцитарных дендритных клеток больных раком молочной железы / Л. П. Титов, А. Е. Гончаров, Л. А. Путырский [и др.] // Здравоохранение. – 2010. – № 10. – С. 52–55.

17. Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica / О. Ю. Реброва. – М.: Медиа Сфера, 2003. – 312 с.

18. CD83 Regulates the Immune Responses in Inflammatory Disorders / B. Riaz, S. Islam, H. Ryu, S. Sohn // International Journal of Molecular Sciences. – 2023. – Vol. 24, N 3. – Art. 2831. https://doi.org/10.3390/ijms24032831