vestibИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Biological Series1029-89402524-230XThe Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1029-8940-2026-71-1-44-55vestib-996Research ArticleСтатьиПолучение рекомбинантного белка человеческого фактора некроза опухоли-альфа в клет- ках бактерий Escherichia coli и оценка его биологической активностиObtaining of the human recombinant tumor necrosis factor-alpha protein in Escherichia coli cells and evaluation of its biological activityhttps://orcid.org/0000-0003-4245-4310КопылеваД. В.KopylevaD. V.

Копылева Дарья Викторовна – аспирант, мл. науч. сотрудник

пр-т Независимости, 4, 220030, г. Минск

Darya V. Kopyleva – Postgraduate Student, Junior Re- searcher

 

kopyleva.d@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-2473-416XПрокулевичВ. А.PrakulevichU. A.

Прокулевич Владимир Антонович – д-р биол. наук, профессор, гл. науч. сотрудник

пр-т Независимости, 4, 220030, г. Минск

Uladzimir A. Prakulevich – D. Sc. (Biol.), Professor, Chief Researcher

4, Nezavisimosti Ave., 220030, Minsk

prokulevich@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4753-5558ПотаповичМ. И.PatapovichM. I.

Потапович Максим Иосифович – заведующий лабораторией

пр-т Независимости, 4, 220030, г. Минск

Maksim I. Patapovich – Head of the Laboratory

4, Nezavisimosti Ave., 220030, Minsk

 

potapovich@bsu.byhttps://orcid.org/0000-0002-8172-9092ДужЕ. В.DuzhE. V.

Дуж Елена Васильевна – канд. биол. наук, заведующий лабораторией

ул. Академическая, 27, 220072, г. Минск

Elena V. Duzh – Ph. D. (Biol.), Head of the Laboratory

4, Nezavisimosti Ave., 220030, Minsk

lenaduzh@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-4869-9864ГончаровА. Е.HancharouA. E.

Гончаров Андрей Евгеньевич – канд. мед. наук, доцент, директор

ул. Академическая, 27, 220072, г. Минск

Andrei E. Hancharou – Ph. D. (Med.), Associate Pro- fessor, Director

27, Akademicheskaya Str., 220072, Minsk

andrei.hancharou@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-9535-7157АнтоневичН. Г.AntonevichN. G.

Антоневич Наталья Георгиевна – канд. биол. наук, доцент, вед. науч. сотрудник

ул. Академическая, 27, 220072, г. Минск

Natalia G. Antonevich – Ph. D. (Biol.), Associate Pro- fessor, Leading Researcher

27, Akademicheskaya Str., 220072, Minsk

antonevich.n@gmail.comБушмакинаИ. М.BushmakinaI. M.

Бушмакина Ирина Михайловна – канд. биол. наук, за- ведующий сектором

ул. Академическая, 27, 220072, г. Минск

Iryna M. Bushmakina – Ph. D. (Biol.), Head of the Laboratory

27, Akademicheskaya Str., 220072, Minsk

bushmim@yandex.ruБелорусский государственный университетBelarusian State UniversityИнститут биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук БеларусиInstitute of Biophysics and Cell Engineering of the National Academy of Sciences of Belarus2026020220267114455Copyright © Копылева Д.В., Прокулевич В.А., Потапович М.И., Дуж Е.В., Гончаров А.Е., Антоневич Н.Г., Бушмакина И.М., 20262026Копылева Д.В., Прокулевич В.А., Потапович М.И., Дуж Е.В., Гончаров А.Е., Антоневич Н.Г., Бушмакина И.М.Kopyleva D.V., Prakulevich U.A., Patapovich M.I., Duzh E.V., Hancharou A.E., Antonevich N.G., Bushmakina I.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestibio.belnauka.by/jour/article/view/996

В работе представлены ключевые стадии получения субстанции рекомбинантного человеческого фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) в клетках бактерий Escherichia coli. Описаны этапы конструирования нук- леотидной последовательности и клонирование гена в составе вектора pET24b(+) под промотором бактериофага Т7. Сконструирован потенциальный штамм-продуцент рекомбинантного белка на основе E. coli BL21-Gold(DE3), способный к наработке растворимой формы ФНО-α в количестве, превышающем 30 % от общего белка клетки. Осуществлена очистка целевого белка с использованием тандемной ионообменной и эксклюзионной хроматографий. Определена биологическая активность полученного образца в рамках стандартного протокола производства биомедицинских клеточных продуктов на основе дендритных клеток (ДК). Установлена жизнеспособность ДК, достоверно не отличающаяся в контрольной и опытной группах и превышающая 90 %. Вместе с тем образец ФНО-α характеризуется усилением экспрессии молекул-маркеров зрелых ДК CD83 и HLA-DR. Полученные данные свидетельствуют о высокой иммунобиологической активности в сравнении с доступным коммерческим препаратом, а также о потенциальной возможности импортозамещения.

The paper presents the key stages of obtaining recombinant human tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in Escherichia coli cells. The stages of constructing and cloning the gene in the pET24b(+) vector under the T7 bacteriophage promoter are described. A potential strain producing the recombinant protein based on E. coli BL21-Gold(DE3) was constructed, capable of producing a soluble form of TNF-α in an amount exceeding 30 % of the total cellular protein. Purification of the target protein was carried out using tandem ion-exchange and size-exclusion chromatography. Biological activity of the obtained protein was determined using the standard protocol for the production of biomedical cell products based on dendritic cells (DC). The viability of DC was established, which did not differ in the control and experimental groups and exceeded 90 %. At the same time, the TNF-α sample is characterized by increased expression of mature DC marker molecules CD83 and HLA-DR. The obtained data indicate high immunobiological activity in comparison with the available commercial preparation and the potential for import substitution.

фактор некроза опухоли-альфаEscherichia coliхроматографияиндукция биосинтезаклонированиеэкспрессияэндотоксиныдендритные клеткибиомедицинские клеточные продуктыCD83HLA-DRпроточная цитофлуориметрияtumor necrosis factor-alphaEscherichia colichromatographyinduction of biosynthesiscloningexpressionendotoxinsdendritic cellsbiomedical cell productsCD83HLA-DRflow cytofluorometryReferences. Transmembrane TNF-a: structure, function and interaction with anti-TNF agents / T. Horiuchi, H. Mitoma, S. Harashima [et al.] // Rheumatology. – 2010. – Vol. 49, N 7. – P. 1215–1228. https://doi.org/10.1093/rheumatology/keq031Horiuchi T., Mitoma H., Harashima S., Tsukamoto H., Shimoda T. Transmembrane TNF-a: structure, function and interaction with anti-TNF agents. Rheumatology, 2010, vol. 49, no. 7, pp. 1215–1228. https://doi.org/10.1093/rheumatology/keq031Eck, M. J. The Structure of Tumor Necrosis Factor-α at 2.6 Å Resolution / M. J. Eck, S. R. Sprang // Journal of Biological Chemistry. – 1989. – Vol. 264, N 29. – P. 17595–17605. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)71533-0Eck M. J., Sprang S. R. The Structure of Tumor Necrosis Factor-α at 2.6 Å Resolution. Journal of Biological Chemistry, 1989, vol. 264, no. 29, pp. 17595–17605. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)71533-0A Domain in TNF Receptors That Mediates Ligand-Independent Receptor Assembly and Signaling / F. K. M. Chan, H. J. Chun, L. Zheng [et al.] // Science. – 2000. – Vol. 288, N 5475. – P. 2351–2354. https://doi.org/10.1126/science.288.5475.2351Chan F. K. M., Chun H. J., Zheng L., Siegel R. M., Bui K. L., Lenardo M. J. A Domain in TNF Receptors That Mediates Ligand-Independent Receptor Assembly and Signaling. Science, 2000, vol. 288, no. 5475, pp. 2351–2354. https://doi.org/10.1126/science.288.5475.2351Chu, W. M. Tumor necrosis factor / W. M. Chu // Cancer Letters. – 2013. – Vol. 328, N 2. – P. 222–225. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2012.10.014Chu W. M. Tumor necrosis factor. Cancer Letters, 2013, vol. 328, no. 2, pp. 222–225. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2012.10.01Stability Program in Dendritic Cell Vaccines: A “Real-World” Experience in the Immuno-Gene Therapy Factory of Romagna Cancer Center / E. Pancisi, A. M. Granato, E. Scarpi [et al.] // Vaccines. – 2022. – Vol. 10, N 7. – Art. 999. https:// doi.org/10.3390/vaccines10070999 Proceedings of the National Academy of SPancisi E., Granato A. M., Scarpi E., Ridolfi L., Carloni S., Moretti C., Guidoboni M. [et al.]. Stability Program in Dendritic Cell Vaccines: A “Real-World” Experience in the Immuno-Gene Therapy Factory of Romagna Cancer Center. Vaccines, 2022, vol. 10, no. 7, art. 999. https://doi.org/10.3390/vaccines10070999Advanced therapy medicinal products: current and future perspectives / Е. Hanna, C. Rémuzat, P. Auquier, M. Toumi // Journal of Market Access and Health Policy. – 2016. – Vol. 4, N 1. – Art. 31036. https://doi.org/10.3402/jmahp.v4.31036Hanna Е., Rémuzat C., Auquier P., Toumi M. Advanced therapy medicinal products: current and future perspectives. Journal of Market Access & Health Policy, 2016, vol. 4, no. 1, art. 31036. https://doi.org/10.3402/jmahp.v4.31036Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1977. – Vol. 74, N 12. – P. 5463–5467. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1977, vol. 74, no. 12, pp. 5463–5467. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463Current protocols in molecular biology / eds.: F. M. Ausbel, R. Brent, R. E. Kingston [et al.]. – New York: John Wiley & Sons, 2003. – 4648 p.Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D. D., Seidman J. G., Smith J. A., Struhl K. (eds.). Current protocols in molecular biology. New York, John Wiley & Sons, 2003. 4648 p.Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, N 5259. – P. 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, no. 5259, pp. 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server / E. Gasteiger, Ch. Hoogland, A. Gattiker [et al.] // The Proteomics Protocols Handbook / ed. J. M. Walker. – Totowa, NJ, 2005. – P. 571–607. https://doi.org/10.1385/1-59259890-0:571Gasteiger E., Hoogland Ch., Gattiker A., Duvaud S’., Wilkins M. R., Appel R. D., Bairoch A. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Totowa, NJ, 2005, pp. 571–607. https://doi.org/10.1385/1-59259-890-0:571Burland, T. G. DNASTAR’s Lasergene Sequence Analysis Software / T. G. Burland // Bioinformatics Methods and Protocols / eds.: S. Misener, S. A. Krawetz. – Totowa, NJ, 1999. – Vol. 132. – P. 71–91. https://doi.org/10.1385/1-59259-192-2:71Burland T. G. DNASTAR’s Lasergene Sequence Analysis Software. Bioinformatics Methods and Protocols. Vol. 132. Totowa, NJ, 1999, pp. 71–91. https://doi.org/10.1385/1-59259-192-2:71Peden, J. F. Analysis of Codon Usage: diss. … for the degree of Dr. of Philosophy / John F. Peden; University of Nottingham. – Nottingham, 2000. – 215 p.Peden J. F. Analysis of Codon Usage. Ph. D. Thesis. Nottingham, 2000. 215 p.Shneider, C. A. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis / C. A. Shneider, W. S Rasband, K. W. Eliceiri // Nature Methods. – 2012. – Vol. 9, N 7. – P. 671–675. https://doi.org/10.1038/nmeth.2089Shneider C. A., Rasband W. S, Eliceiri K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis. Nature Methods, 2012, vol. 9, no. 7, pp. 671–675.Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry / M. Gassman, B. Grenacher, B. Rohde, J. Vogel // Electrophoresis. – 2009. – Vol. 30, N 11. – P. 1845–1855. https://doi.org/10.1002/elps.200800720Gassman M., Grenacher B., Rohde B., Vogel J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis, 2009, vol. 30, no. 11, pp. 1845–1855. https://doi.org/10.1002/elps.200800720Характеристика дендритных клеток для иммунотерапии рака поджелудочной железы / А. Е. Гончаров, И. В. Романов, И. В. Залуцкий [и др.] // Известия Нациаональной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук. – 2014. – № 2. – С. 4–12.Goncharov A. E., Romanova I. V., Zalutskii I. V., Prokhorov A. V., Papok V. I. Characterization of dendritic cells for immunotherapy of pancreatic cancer. Vestsі Natsyyanal’nai akademіі navuk Belarusі. Seryya medytsynskіkh navuk = Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Medical series, 2014, no. 2, pp. 4–12 (in Russian).Иммунофенотип и функциональные свойства моноцитарных дендритных клеток больных раком молочной железы / Л. П. Титов, А. Е. Гончаров, Л. А. Путырский [и др.] // Здравоохранение. – 2010. – № 10. – С. 52–55.Titov L. P., Goncharov A. E., Putyrskii L. A., Koshelev S. V., Kosheleva M. I., Putyrskii Yu. L. Immunophenotype and functional properties of monocytic dendritic cells of breast cancer patients. Zdravookhranenie [Healthcare], 2010, no. 10, pp. 52–55 (in Russian).Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica / О. Ю. Реброва. – М.: Медиа Сфера, 2003. – 312 с.Rebrova O. Yu. Statistical Analysis of Medical Data. Using the Statistica Software Package. Мoskow, Media Sfera Publ., 2003. 312 p (in Russian).CD83 Regulates the Immune Responses in Inflammatory Disorders / B. Riaz, S. Islam, H. Ryu, S. Sohn // International Journal of Molecular Sciences. – 2023. – Vol. 24, N 3. – Art. 2831. https://doi.org/10.3390/ijms24032831Riaz B., Islam S., Ryu H., Sohn S. CD83 Regulates the Immune Responses in Inflammatory Disorders. International Journal of Molecular Sciences, 2023, vol. 24, no. 3, art. 102–124. https://doi.org/10.3390/ijms24032831

The authors declare that there are no conflicts of interest present.