Клонирование кДНК глюкоамилазы Aspergillus awamori в интегративный вектор для мицелиальных грибов методом кольцевой полимеразной реакции

C использованием метода кольцевой полимеразной реакции (circular polymerase extension cloning, СРЕС) было проведено успешное клонирование кДНК гена глюкоамилазы Aspergillus awamori в интегративный вектор для мицелиальных грибов pH4Hyg. Вначале были проведены две полимеразные цепные реакции (ПЦР). В результате первой амплифицирована кДНК гена glaA, ранее клонированная в плазмиду на основе вектора pBluescript II SK(-), в результате второй - вектор pH4Hyg в линейной форме, содержащий промотор и терминатор целевого гена. Полученные ампликоны были очищены от компонентов смеси ПЦР. После 20 циклов реакции СРЕС была синтезирована конечная генетическая конструкция pH4HygPTgla, которая может использоваться в создании штаммов мицелиальных грибов, секретирующих глюкоамилазу в стабильной конформации, обладающую биотехнологически значимыми свойствами.

1. Glucoamylase: structure/function relationships, and protein engineering / J. Sauer [et al.] // Biochim. Biophys. Acta (BBA) - Protein Str. Mol. Enzym. - 2000. - Vol. 1543, N 2. - P. 275-293. https://doi.org/10.1016/s0167-4838(00)00232-6

2. Marin-Navarro, J. Glucoamylases: structural and biotechnological aspects / J. Marin-Navarro, J. Polaina // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - Vol. 89, N 5. - P. 1267-1273. https://doi.org/10.1007/s00253-010-3034-0

3. Грачева, И. М. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева, A. Ю. Кривова. - М. : Элевар, 2000. - 512 с.

4. Kumar, P. Microbial glucoamylases: characteristics and applications / P. Kumar, T. Satyanarayana // Crit. Rev. Biotechnol. -2009. - Vol. 29, N 3. - P. 225-255. https://doi.org/10.1080/07388550903136076

5. Coutinho, P. M. Glucoamylase structural, functional, and evolutionary relationships / P. M.Coutinho, P. J. Reilly // Proteins: Struct. Funct. Genet. - 1997. - Vol. 29, N 3. - P. 334-347. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0134(199711)29:3334:aid-prot73.0.co;2-a

6. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases / D. G. Gibson [et al.] // Nat. Meth. - 2009. -Vol. 6, N 5. - P. 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

7. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome / D. G. Gibson [et al.] // Science. - 2010. -Vol. 329, N 5987. - P. 52-56. https://doi.org/10.1126/science.1190719

8. Rapid hierarchical assembly of medium-size DNA cassettes / J. L. Schmid-Burgk [et al.] // Nucl. Acids Res. - 2012. -Vol. 40, N 12. - P. e92. https://doi.org/10.1093/nar/gks236

9. Datsenko, K. A. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products / K. A. Datsenko, B. L. Wanner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97, N 12. - P. 6640-6645. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297

10. Watson, J. F. In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: a re-emerging tool to simplify molecular cloning / J. F. Watson, J. Garcia-Nafria // J. Biol. Chem. - 2019. - Vol. 294, N 42. - P. 15271-15281. https://doi.org/10.1074/jbc.rev119.009109

11. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes / A. J. M. Walhout [et al.] // Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins - Part C: Protein-Protein Interactions and Genomics / ed. : J. Thorner, S. D. Emr, J. N. Abelson. - New York ; London, 2000. - P. 575-592. - (Methods in Enzymology ; Vol. 328).

12. Quan, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways / J. Quan, J. Tian // PloS ONE. -2009. - Vol. 4, N 7. - P. e6441. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006441

13. Bryksin, A. V. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids /A. V. Bryksin, I. Matsumura // Biotechniques. - 2010. - Vol. 48, N 6. - P. 463-465. https://doi.org/10.2144/000113418

14. Zuo, P. One-step DNA fragment assembly and circularization for gene cloning / P. Zuo, A. B. M. Rabie // Curr. Iss. Mol. Biol. - 2009. - Vol. 12, N 1. - P. 11-16.