Условия выделения рекомбинантного бычьего альфа-интерферона из телец включения E. coli

Эффективность рекомбинантного бычьего альфа-интерферона (rbIFN-α), как и других белков данной группы, обусловлена тем, что при проведении антивирусной терапии он стимулирует и модулирует противовирусную активность ряда клеток-мишеней в ответ на вирусную атаку.
Данное исследование посвящено определению оптимальных условий выделения, очистки и рефолдинга методом разведения rbIFN-α из телец включения (ТВ) E. coli. Основными методами являлись спектрофотометрические, электрофоретические, хроматографические и рефолдинг методом разведения.
Двухстадийная отмывка ТВ растворами на основе 50 ммоль/л Трис, 50 ммоль/л NaCl и 3,5 моль/л мочевины и их последующая солюбилизация в растворе с 50 ммоль/л Трис-HCl, pH 9,0, 8 моль/л мочевины и 20 ммоль/л β-меркаптоэтанола позволили получить целевой белок в мономерной форме с чистотой 53,18 ± 9,3 %. Применение тандемной ионообенной хроматографии на последовательно соединенных колонках с DE 52 целлюлозой и toyopearl DEAE-650 M дало возможность получить целевой rbIFN-α с чистотой 80,7 ± 8,6 %. В результате скрининга основных характеристик определен следующий состав рефолдинга буфера для проведения ренатурации рекомбинантного rbIFN-α: 10 ммоль/л NaPB, pH 7,4, 0,4 моль/л сахароза, 1 ммоль/л ЭДТА, 1 ммоль/л L-Цис, 0,1 ммоль/л L-цистина, 0,05 % Kolliphor EL. На конечном этапе сбора целевого белка с помощью данной системы выход мономерной формы rbIFN-α составил 20,44 ± 1,1 %, чистота – 98,43 %, активность – (5 ± 3,6)•106 МЕ/мг.

1. Capon, D. J. Two distinct families of human and bovine interferon-alpha genes are coordinately expressed and encode functional polypeptides / D. J. Capon, H. M. Shepard, D. V. Goeddel // Mol. Cell. Biol. – 1985. – Vol. 5, N 4. – P. 768–779. https://doi.org/10.1128/mcb.5.4.768

2. Stability of recombinant bovine interferon‐γ antiviral activity in the absence of stabilizing additives / Q. Xu [et al.] // Microbiol. Immunol. – 2011. – Vol. 55, N 8. – P. 595–598. https://doi.org/10.1111/j.1348-0421.2011.00349.x

3. Arora, D. Method for increasing the yield of properly folded recombinant human gamma interferon from inclusion bodies / D. Arora, N. Khanna // J. Biotechnol. – 1996. – Vol. 52, N 2. – P. 127–133. https://doi.org/10.1016/S0168-1656(96)01636-7

4. A slow release formulation for recombinant bovine interferon αI-1 / H. Hughes [et al.] // Antiviral Res. – 1994. – Vol. 23, N 1. – P. 33–44. https://doi.org/10.1016/0166-3542(94)90031-0

5. Rudolph, R. In vitro folding of inclusion body proteins / R. Rudolph, H. Lilie // FASEB J. – 1996. – Vol. 10. – N 1. – P. 49–56. https://doi.org/10.1096/fasebj.10.1.8566547

6. Guise, A. D. Protein folding in vivo and renaturation of recombinant proteins from inclusion bodies / A. D. Guise, S. M. West, J. B. Chaudhuri // Mol. Biotechnol. – 1996. – Vol. 6, N 1. – P. 53–64. https://doi.org/10.1007/BF02762323

7. Refolding, isolation and characterization of crystallizable human interferon-α8 expressed in Saccharomyces cerevisiae / S. Di Marco [et al.] // J. Biotechnol. – 1996. – Vol. 50, N 1. – P. 63–73. https://doi.org/10.1016/0168-1656(96)01550-7

8. Molecular characterization of recombinant human interferon alpha-2b produced in Cuba / H. Santana [et al.] // Biotecnol. Apl. – 1999. – Vol. 16, N 3. – P. 154–159.

9. Refolding and purification of interferon-gamma in industry by hydrophobic interaction chromatography / X. Geng [et al.] // J. Biotechnol. – 2004. – Vol. 113, N 1–3. – P. 137–149. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2004.06.006

10. Shin, H.-C. Protein folding, misfolding, and refolding of therapeutic proteins / H.-C. Shin // Biotechnol. Bioprocess Eng. – 2001. – Vol. 6, N 4. – P. 237–243. https://doi.org/10.1007/BF02931984

11. Lilie, H. Advances in refolding of proteins produced in E. coli / H. Lilie, E. Schwarz, R. Rudolph // Curr. Opin. Biotechnol. – 1998. – Vol. 9, N 5. – P. 497–501. https://doi.org/10.1016/S0958-1669(98)80035-9

12. Оптимизация условий очистки и рефолдинга рекомбинантного эфрина-А5 из телец включения Escherichia coli / А. В. Жидецкий [и др.] // Журн. Белорус. гос. ун-та. Биология. – 2017. – № 2. – С. 58–65.

13. Rubinstein, S. Convenient assay for interferons / S. Rubinstein, P. C. Familletti, S. Pestka // J. Virol. – 1981. – Vol. 37, N 2. – P. 755–758.

14. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, N 5259. – P. 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0

15. Fairbanks, G. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane / G. Fairbanks, T. L. Steck, D. F. H. Wallach // Biochemistry. – 1971. – Vol. 10, N 13. – P. 2606–2617. https://doi.org/10.1021/bi00789a030

16. A simplification of Heukeshoven and Dernick’s silver staining of proteins / C. Damerval [et al.] // Electrophoresis. – 1987. – Vol. 8, N 3. – P. 158–159. https://doi.org/10.1002/elps.1150080308

17. Peterson, G. L. Determination of total protein / G. L. Peterson // Meth. Enzymol. – 1983. – Vol. 91. – P. 95–119. https:// doi.org/10.1016/S0076-6879(83)91014-5

18. Georgiou, G. Isolating inclusion bodies from bacteria / G. Georgiou, P. Valax // Meth. Enzymol. – 1999. – Vol. 309. – P. 48–58. https://doi.org/10.1016/S0076-6879(99)09005-9

19. Clark, E. D. B. Refolding of recombinant proteins / E. D. B. Clark // Curr. Opin. Biotechnol. – 1998. – Vol. 9, N 2. – P. 157–163. https://doi.org/10.1016/S0958-1669(98)80109-2

20. Misawa, S. Refolding of therapeutic proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies / S. Misawa, I. Kumagai // Biopolymers (Peptide Sci.). – 1999. – Vol. 51, N 4. – P. 297–307. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0282(1999)51:4<297::aid-bip5>3.0.co;2-i

21. Vallejo, L. F. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins / L. F. Vallejo, U. Rinas // Microb. Cell Fact. – 2004. – Vol. 3. – Art. 11. https://doi.org/10.1186/1475-2859-3-11

22. Middelberg, A. P. Preparative protein refolding / A. P. Middelberg // Trends Biotechnol. – 2002. – Vol. 20, N 10. – P. 437–443. https://doi.org/10.1016/S0167-7799(02)02047-4

23. Porterfield, J. Z. A simple and general method for determining the protein and nucleic acid content of viruses by UV absorbance / J. Z. Porterfield, A. Zlotnick // Virology. – 2010. – Vol. 407, N 2. – P. 281–288. https://doi.org/10.1016/j.virol.2010.08.015

24. Tran-Moseman, A. D. Renaturation of Escherichia coli-derived recombinant human macrophage colony-stimulating factor / A. D. Tran-Moseman, N.Schauer, E. de Bernardez Clark // Protein Expression and Purification. – 1999. – Vol. 16, N 1. – P. 181–189. https://doi.org/10.1006/prep.1999.1074

25. Salaman, M. R. Isoelectric focusing of proteins in the native and denatured states. Anomalous behaviour of plasma albumin / M. R. Salaman, A. R. Williamson // Biochem. J. – 1971. – Vol. 122, N 1. – P. 93–99. https://doi.org/10.1042/bj1220093

26. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis myth or reality? / J. McCarthy [et al.] // J. Proteome Res. – 2003. – Vol. 2, N. 3. – P. 239–242. https://doi.org/10.1021/pr025564b

27. Armstrong, N. A new protein folding screen: application to the ligand binding domains of a glutamate and kainate receptor and to lysozyme and carbonic anhydrase / N. Armstrong, A. de Lencastre, E. Gouaux // Protein Sci. – 1999. – Vol. 8, N 7. – P. 1475–1483. https://doi.org/10.1110/ps.8.7.1475

28. Eiberle, M. K. Technical refolding of proteins: do we have freedom to operate? / M. K. Eiberle, A. Jungbauer // Biotechnol. J. – 2010. – Vol. 5, N 6. – P. 547–559. https://doi.org/10.1002/biot.201000001