Редактирование генома картофеля с помощью системы CRISPR/Cas9 для нокаута генов StDMR6-1 и StCHL1, вовлеченных в устойчивость к фитофторозу

Методом Agrobacterium-опосредованной трансформации в геном сортов картофеля белорусской селекции Першацвет, Юлия, Красавик были введены векторные генетические конструкции, несущие в своем составе элементы системы CRISPR/Cas9 для нокаута генов регуляторов защитных реакций StDMR6-1 и StCHL1. Нокаут данных генов (S-генов) является перспективным, актуальным и современным подходом для повышения устойчивости картофеля к фитофторозу. Получено 288 трансгенных растений картофеля Т₀ поколения, 161 из которых было проанализировано на наличие мутационных событий инсерционно-делеционного типа с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. При этом из 161 трансформанта Т₀ поколения 84 имели мутантные последовательности генов StCHL1 и StDMR6-1 с частотой встречаемости мутаций от 1 до 97 % при р < 0,001 и 99,2 % при р ≥ 0,001 в зависимости от сорта. В результате эксперимента впервые в Республике Беларусь были получены генетически редактированные растения картофеля сортов белорусской селекции Юлия, Першацвет, Красавик, несущие мутации генов StCHL1 и StDMR6-1, приводящие к сдвигу рамки считывания и, как следствие, к нокауту генов.

1. Potato. Nutrition and Food Security / P. Raigond, B. Singh, S. Dutt, S. K. Chakrabarti – Singapore: Springer, 2020. – 287 p.

2. The Potato of the Future: Opportunities and Challenges in Sustainable Agri-food Systems / A. Devaux, J.-P. Goffart, P. Kromann [et al.] // Potato Research. – 2021. – Vol. 64, N 4. – P. 681–720. https://doi.org/10.1007/s11540-021-09501-4

3. Fry, W. Phytophthora infestans: the plant (and R gene) destroyer / W. Fry // Molecular Plant Pathology. – 2008. – Vol. 9, N 3. – P. 385–402. https://doi.org/10.1111/j.1364-3703.2007.00465.x

4. Silencing of six susceptibility genes results in potato late blight resistance / K. Sun, A.-M. A. Wolters, J. H. Vossen [et al.] // Transgenic Research. – 2016. – Vol. 25, N 5. – Р. 731–742. https://doi.org/10.1007/s11248-016-9964-2

5. Шишлова-Соколовская, А. М. Создание векторных конструкций, несущих CRISPR/Cas9 систему, для направленного мутагенеза генов CHL1 и DMR6-1 Solanum tuberosum / А. М. Шишлова-Соколовская, О. Ю. Урбанович // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. – Мн., 2025. – Т. 38. – C. 24–35.

6. Jones, J. D. G. The plant immune system / J. D. G. Jones, J. L. Dangl // Nature. – 2006. – Vol. 444, N 7117. – P. 323–329. https://doi.org/10.1038/nature05286

7. AVR2 Targets BSL Family Members, Which Act as Susceptibility Factors to Suppress Host Immunity / D. Turnbull, H. Wang, S. Breen [et al.] // Plant Physiology. – 2019. – Vol. 180, N 1. – P. 571–581. https://doi.org/10.1104/pp.18.01143

8. RXLR Effector AVR2 Up-Regulates a Brassinosteroid-Responsive bHLH Transcription Factor to Suppress Immunity / D. Turnbull, L. Yang, S. Naqvi [et al.] // Plant Physiology. – 2017. – Vol. 174, N 1. – P. 356–369. https://doi.org/10.1104/pp.16.01804

9. Vlot, A. C. Salicylic Acid, a Multifaceted Hormone to Combat Disease / A. C. Vlot, D. A. Dempsey, D. F. Klessig // Annual Review of Phytopathology. – 2009. – Vol. 47. – P. 177–206. https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.050908.135202

10. Mutations introduced in susceptibility genes through CRISPR/Cas9 genome editing confer increased late blight resistance in potatoes / N. P. Kieu, M. Lenman, E. S. Wang [et al.] // Scientific Reports. – 2021. – Vol. 11, N 1. – Art. 4487. https://doi.org/10.1038/s41598-021-83972-w

11. CRISPR/Cas9 genome editing of potato StDMR6-1 results in plants less affected by different stress conditions / M. Karlsson, N. P. Kieu, M. Lenman [et al.] // Horticulture Research. – 2024. – Vol. 11, N 7. – Art. uhae130. https://doi.org/10.1093/hr/uhae130

12. CRISPR/Cas9 editing of Downy mildew resistant 6 (DMR6-1) in grapevine leads to reduced susceptibility to Plasmopara viticola / S. Djennane, S. Gersch, F. Le-Bohec [et al.] // Journal of Experimental Botany. – 2024. – Vol. 75, N 7. – P. 2100–2112. https://doi.org/10.1093/jxb/erad487

13. Маренкова, Т. В. Мозаичный характер экспрессии трансгенов у растений / Т. В. Маренкова, Д. Б. Логинова, Е. В. Дейнеко // Генетика. – 2012. – Т. 48, № 3. – С. 293–306.

14. Маренкова, Т. В. Особенности экспрессии чужеродных генов в сложноорганизованных инсерциях у трансгенных растений табака с мозаичным характером проявления гена nptII / Т. В. Маренкова, В. В. Кузнецов, Е. В. Дейнеко // Генетика. – 2021. – Т. 57, № 3. – С. 321–331.

15. Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data / D. Conant, T. Hsiau, N. Rossi [et al.] // The CRISPR Journal. – 2022. – Vol. 5, N 1. – P. 123–130. https://doi.org/10.1089/crispr.2021.0113

16. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition / E. K. Brinkman, T. Chen, M. Amendola, B. Steensel // Nucleic Acids Research. – 2014. – Vol. 42, N 22. – P. e168. https://doi.org/10.1093/nar/gku936

17. Brinkman, E. K. Rapid Quantitative Evaluation of CRISPR Genome Editing by TIDE and TIDER / E. K. Brinkman, B. van Steensel // CRISPR Gene Editing. – 2019. – Vol. 1961. – P. 29–44. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9170-9_3

18. A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants / X. Ma, Q. Zhang, Q. Zhu [et al.] // Molecular Plant. – 2015. – Vol. 8, N 8. – Р. 1274–1284. https://doi.org/10.1016/j.molp.2015.04.007

19. Mikami, M. Parameters affecting frequency of CRISPR/Cas9 mediated targeted mutagenesis in rice / M. Mikami, S. Toki, M. Endo // Plant Cell Reports. – 2015. – Vol. 34, N 10. – Р. 1807–1815. https://doi.org/10.1007/s00299-015-1826-5

20. Xie, K. RNA-Guided Genome Editing in Plants Using a CRISPR–Cas System / K. Xie, Y. Yang // Molecular Plant. – 2013. – Vol. 6, N 6. – P. 1975–1983. https://doi.org/10.1093/mp/sst119

21. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system / Z. Feng, B. Zhang, W. Ding [et al.] // Cell Research. – 2013. – Vol. 23, N 10. – P. 1229–1232. https://doi.org/10.1038/cr.2013.114

22. Schöb, H. Silencing of transgenes introduced into leaves by agroinfiltration: a simple, rapid method for investigating sequence requirements for gene silencing / H. Schöb, C. Kunc, F. Meins // Molecular and General Genetics MGG. – 1997. – Vol. 256, N 5. – P. 581–585. https://doi.org/10.1007/s004380050604

23. Yi, M. Communication Between Filamentous Pathogens and Plants at the Biotrophic Interface / M. Yi, B. Valent // Annual Review of Phytopathology. – 2013. – Vol. 51. – P. 587–611. https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-081211-172916

24. Salicylic acid 3-hydroxylase regulates Arabidopsis leaf longevity by mediating salicylic acid catabolism / K. Zhang, R. Halitschke, C. Yin [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2013. – Vol. 110, N 36. – P. 14807–14812. https://doi.org/10.1073/pnas.1302702110