CRISPR/Cas9-опосредованный направленный мутагенез гена PDS Nicotiana tabacum L.

Система CRISPR/Cas9 является одним из эффективных инструментов для редактирования геномов растений. С помощью этой системы нами получены трансформанты Nicotiana tabacum с различным фенотипом, несущие в своем геноме мутационные события инсерционно-делеционного типа в гене PDS, кодирующем фермент 15-цис-фитоендесатуразу. Эндогенный ген табака NtPDS был выбран в качестве мишени, так как внесение мутаций в его нуклеотидную последовательность позволяет легко визуализировать признаки. Тетрааллельный нокаут гена NtPDS приводил к полному альбинизму растений. Трансформанты-альбиносы отличались более медленным ростом, карликовостью и были нежизнеспособны при культивировании in vitro. Мутанты с пестролистностью в культуре in vitro образовывали корни и не отличались от контрольных растений по размеру листьев. Анализ нуклеотидной последовательности протоспейсера гена мишени NtPDS был выполнен на случайной выборке, включавшей 21 трансгенное растение поколения Т0 с различным фенотипом – от полностью альбиносного до дикого типа. Результаты секвенирования показали, что все трансформанты с видимыми фенотипическими проявлениями несут мутантные последовательности в гене NtPDS с частотой 51,0‒80,0 %, при этом эффективность направленного мутагенеза составила 33,33 %. У трансформантов с фенотипом дикого типа не обнаружено мутированных последовательностей в мишени.

1. Modern trends in plant genome editing: an inclusive review of the CRISPR/Cas9 toolbox / A. Razzaq [et al.] // Int. J. Mol. Sci. – 2019. – Vol. 20, N 16. ‒ Art. 4045. https://doi.org/10.3390/ijms20164045

2. Applications of CRISPR/Cas9 technology for modification of the plant genome / S. Deb [et al.] // Genetica. – 2022. – Vol. 150. – P. 1–12. https://doi.org/10.1007/s10709-021-00146-2

3. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA / H. Nishimasu [et al.] // Cell. – 2014. – Vol. 156, N 5. – P. 935‒949. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001

4. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation / M. Jinek [et al.] // Science. – 2014. – Vol. 343, N 6176. ‒ Art. 1247997. https://doi.org/10.1126/science.1247997

5. Devkota, S. The road less traveled: strategies to enhance the frequency of homology-directed repair (HDR) for increased efficiency of CRISPR/Cas-mediated transgenesis / S. Devkota // BMB Rep. – 2018. – Vol. 51, N 9. – P. 437‒443. https://doi.org/10.5483/BMBRep.2018.51.9.187

6. Jasin, M. The democratization of gene editing: Insights from site-specific cleavage and double-strand break repair / M. Jasin, J. E. Haber // DNA Repair (Amst.). – 2016. – Vol. 44. – P. 6‒16. https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2016.05.001

7. Shrivastav, M. Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice / M. Shrivastav, L. P. De Haro, J. A. Nickoloff // Cell Res. – 2008. – Vol. 18, N 1. – P. 134‒147. https://doi.org/10.1038/cr.2007.111

8. Pfeiffer, P. Mechanisms of DNA double-strand break repair and their potential to induce chromosomal aberrations / P. Pfeiffer, W. Goedecke, G. Obe // Mutagenesis. – 2000. – Vol. 15, N 4. – P. 289‒302. https://doi.org/10.1093/mutage/15.4.289

9. Norris, S. R. Genetic dissection of carotenoid synthesis in arabidopsis defines plastoquinone as an essential component of phytoene desaturation / S. R. Norris, T. R. Barrette, D. DellaPenna // Plant Cell. – 1995. – Vol. 7, N 12. – P. 2139–2149. https://doi.org/10.1105/tpc.7.12.2139

10. CRISPR/Cas9-mediated efficient editing in phytoene desaturase (PDS) demonstrates precise manipulation in banana cv. Rasthali genome / N. Kaur [et al.] // Funct. Integr. Genomics. – 2018. – Vol. 18, N 1. – P. 89‒99. https://doi.org/10.1105/tpc.7.12.2139

11. Разработка CRISPR/Cas9 системы для геномного редактирования гена NtPDS табака (Nicotiana tabacum) / А. М. Шишлова-Соколовская, Е. П. Хмилевская, О. Ю. Урбанович // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. – 2022. – Т. 33. – С. 47‒57.

12. Tso, T. C. Tobacco research and its relevance to science, medicine and industry / T. C. Tso // Beitrage zur Tabakforschung International / Contrib. Tobacco Res. – 2006. – Vol. 23, N 3. – P. 133‒146. https://doi.org/10.2478/cttr-2013-0848

13. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing of phytoene desaturase in Cassava / J. Odipio [et al.] // Front. Plant Sci. – 2017. – Vol. 8. ‒ P. 1780. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.01780

14. Gene editing the phytoene desaturase alleles of Cavendish banana using CRISPR/Cas9 / F. Naim [et al.] // Transgen. Res. – 2018. – Vol. 5. – P. 451‒460. https://doi.org/10.1007/s11248-018-0083-0

15. Characterization of the Nicotiana tabacum L. genome by molecular cytogenetics / A. Kenton [et al.] // Mol. Gen. Genet. – 1993. – Vol. 240, N 2. – P. 159‒169. https://doi.org/10.1007/BF00277053

16. The ups and downs of genome size evolution in polyploid species of Nicotiana (Solanaceae) / I. J. Leitch [et al.] // Ann. Botany. – 2008. – Vol. 101, N 6. – P. 805–814. https://doi.org/10.1093/aob/mcm326

17. Genome editing in PDS genes of tomatoes by non-selection method and of Nicotiana benthamiana by one single guide RNA to edit two orthologs / H. Komatsu [et al.] // Plant Biotechnol. – 2020 – Vol. 37, N 2. – P. 213–221. https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.20.0527b

18. Efficient genome editing in apple using a CRISPR/Cas9 system / C. Nishitani [et al.] // Nat. Sci. Rep. – 2016. – Vol. 6. ‒ P. 31481. https://doi.org/10.1038/srep31481

19. High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system / P. Wang [et al.] // Plant Biotechnol. J. – 2018. – Vol. 16, N 1. – P. 137‒150. https://doi.org/10.1111/pbi.12755

20. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis / G. Qin [et al.] // Cell Res. – 2007. – Vol. 15. – P. 471‒482. https://doi.org/10.1038/cr.2007.40

21. CRISPR/Cas9-mediated editing of phytoene desaturase gene in onion (Allium cepa L.) / P. Mainkar [et al.] // Front Plant Sci. – 2023. – Vol. 14. ‒ Art. 1226911. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1226911

22. Cazzonelli, C. I. Source to sink: regulation of carotenoid biosynthesis in plants / C. I. Cazzonelli, B. J. Pogson // Trends Plant Sci. – 2010. – Vol. 15, N 5. – P. 266‒274. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2010.02.003

23. Flexibility in photosynthetic electron transport: The physiological role of plastoquinol terminal oxidase (PTOX) / E. Allison [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). – 2011. – Vol. 1807, N 8. – P. 954‒967. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2010.10.024

24. Chlororespiration and cyclic electron flow around PSI during photosynthesis and plant stress response / D. Rumeau [et al.] // Plant Cell Environ. – 2007. – Vol. 30, N 9. – P. 1041‒1051. https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2007.01675.x

25. Lu, Q. S. M. An efficient and specific CRISPR-Cas9 genome editing system targeting soybean phytoene desaturase genes / Q. S. M. Lu, L. Tian // BMC Biotechnol. – 2022. – Vol. 22, N 1. ‒ Art. 7. https://doi.org/10.1186/s12896-022-00737-7

26. Comparison of CRISPR-Cas9/Cas12a ribonucleoprotein complexes for genome editing efficiency in the rice phytoene desaturase (OsPDS) gene / R. Banakar [et al.] // Rice (N. Y.). – 2020. – Vol. 13, N 1. ‒ Art. 4. https://doi.org/10.1186/s12284019-0365-z

27. Efficient targeted mutagenesis in potato by the CRISPR/Cas9 system / S. Wang [et al.] // Plant Cell Rep. – 2015. – Vol. 34. – P. 1473–1476. https://doi.org/10.1007/s00299-015-1816-7

28. Hooghvorst, I. Efficient knockout of phytoene desaturase gene using CRISPR/Cas9 in melon / I. Hooghvorst, C. López-Cristoffanini, S. Nogués, // Sci. Reports. – 2019. – Vol. 9, N 1. ‒ P. 17077. https://doi.org/10.1038/s41598-019-53710-4

29. An agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for high-frequency targeted mutagenesis in maize / S. N. Char [et al.] // Plant Biotechnol. J. – 2017. – Vol. 15, N 2. – P. 257‒268. https://doi.org/10.1111/pbi.12611

30. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system / C. Brooks [et al.] // Plant Physiol. – 2014. – Vol. 166, N 3. – P. 1292–1297. https://doi.org/10.1104/pp.114.247577

31. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9 / T. B. Jacobs [et al.] // BMC Biotechnol. – 2015. – Vol. 15. ‒ Art. 16. https://doi.org/10.1186/s12896-015-0131-2