Подавление побочных реакций ацетилирования прегненолона в трансгенных дрожжах с использованием конкурентного ингибирования и оптимальной системы «вектор – хозяин»

Известно, что прегненолон и продукты его превращения цитохромом Р450 17α-гидроксилаза/17,20-лиаза (P450c17) ‒ 17-гидроксипрегненолон, дегидроэпиандростерон ‒ подвергаются 3-O-ацетилированию ферментом Atf2p дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Нами установлено, что добавление в среду для культивирования изоамилового или амилового спирта уменьшает образование 3-O-ацетилированных продуктов как неиндуцированными, так и индуцированными клетками трансгенных дрожжей S. cerevisiae GRF18/YEp5117α, экспрессирующими P450c17 под контролем промотора GAL10. Более эффективным оказалось использование микроорганизма-хозяина Yarrowia lipolytica и промотора экспрессии изоцитратлиаза ICL1. Анализ генома дрожжей Y. lipolytica с помощью программы BLAST показал отсутствие в них потенциальных аналогов Atf2p, что подтверждено отсутствием продуктов ацетилирования прегненолона. Выбор оптимального организма-хозяина является альтернативой методу получения штамма с удаленными генами.

1. Charney, W. Microbial transformation of steroids / W. Charney, H. L. Herzog. ‒ New York: Academic Press, 1967. ‒ 728 p.

2. Ахрем, А. А. Стероиды и микроорганизмы / А. А. Ахрем, Ю. А. Титов. ‒ М.: Наука, 1970. ‒ 525 с.

3. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments / P. Fernandes [et al.] // Enzyme Microb. Technol. – 2003. – Vol. 32, N 6. – P. 688‒705. https://doi.org/10.1016/S0141-0229(03)00029-2

4. Новые подходы к синтезу стероидов / В. М. Шкуматов [и др.] // Выбраныя навуковыя працы Беларускага дзяржаўнага універсітэта: у 7 т. / В. В. Свірыдаў (адк. рэд.) [і інш.]. ‒ Т. 5: Хімія. – Мінск, 2001. – С. 447‒460.

5. Marsheck, W. J. Microbial degradation of sterols / W. J. Marsheck, S. Kraychy, R. D. Muir // Appl. Microbiol. – 1972. – Vol. 23, N 1. – P. 72‒77. https://doi.org/10.1128/am.23.1.72-77.1972

6. Pregnenolone esterification in Saccharomyces cerevisiae. A potential detoxification mechanism / G. Cauet [et al.] // Eur. J. Biochem. – 1999. – Vol. 261, N 1. – P. 317‒324. https://doi.org/10.1046/j.1432-1327.1999.00282.x

7. Dehydroepiandrosterone (DHEA) metabolism in Saccharomyces cerevisiae expressing mammalian steroid hydroxylase CYP7B: Ayr1p and Fox2p display 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activity / P. Vico [et al.] // Yeast. – 2002. – Vol. 19, N 10. – P. 873‒886. https://doi.org/10.1002/yea.882

8. Биотрансформация стероидов рекомбинантным штаммом дрожжей, экспрессирующим бычий цитохром P-45017α / В. М. Шкуматов [и др.] // Биохимия. – 2002. – Т. 67, № 4. – С. 547‒560.

9. Окисление 17α,20β- и 17α,20α-дигидроксипрегн-4-ен-3-онов, побочных продуктов биотрансформации прогестерона, рекомбинантными микроорганизмами, экспрессирующими цитохром P-45017α / В. М. Шкуматов [и др.] // Биоорган. химия. – 2003. – Т. 29, № 6. – С. 640‒647.

10. Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast / F. M. Szchebara [et al.] // Nat. Biotechnol. – 2003. – Vol. 21, N 2. – P. 143‒148. https://doi.org/10.1038/nbt775

11. Manosroi, J. Enhancement of 17α-hydroxyprogesterone production from progesterone by biotransformation using hydroxypropyl-β-cyclodextrin complexation technique / J. Manosroi, S. Saowakhon, A. Manosroi // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. – 2008. – Vol. 112, N 4–5. – P. 201‒204. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2008.10.003

12. Hydrophobic substrate utilization by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications / P. Fickers [et al.] // FEMS Yeast Res. – 2005. – Vol. 5, N 6–7. – P. 527‒543. https://doi.org/10.1016/j.femsyr.2004.09.004

13. Zinjarde, S. Emulsifier from a tropical marine yeast, Yarrowia lipolytica NCIM 3589 / S. Zinjarde, A. Pant // J. Basic. Microbiol. – 2002. – Vol. 42, N 1. – P. 67‒73. https://doi.org/10.1002/1521-4028(200203)42:1<67::AID-JOBM67>3.0.CO;2-M

14. Mauersberger, S. Cytochrome P450 expression in Yarrowia lipolytica and its use in steroid biotransformation / S. Mauersberger, L. A. Novikova, V. M. Shkumatov // Yarrowia lipolytica / ed. G. Barth. ‒ New York, 2013. ‒ P. 171‒226. https://doi.org/10.1007/978-3-642-38583-4_7

15. Влияние модификаторов биосинтеза стероидов на биотрансформацию прогестерона рекомбинантными микроорганизмами экспрессирующими цитохром P450с17 / В. М. Шкуматов [и др.] // Биомед. химия. – 2006. – Т. 52, № 3. – С. 298‒308.

16. Субстратная специфичность и реакции биотрансформации стероидов, осуществляемые рекомбинантными микроорганизмами Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica, экспрессирующими цитохром Р450c17 / В. М. Шкуматов [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. – 2006. – Т. 42, № 5. – С. 539‒546.

17. Improved campesterol production in engineered Yarrowia lipolytica strains / Yu. Zhang [et al.] // Biotechnol. Lett. – 2017. – Vol. 39, N 7. – P. 1033‒1039. https://doi.org/10.1007/s10529-017-2331-4

18. Pregnenolone overproduction in Yarrowia lipolytica by integrative components pairing of the cytochrome P450scc system / R. Zhang [et al.] // ACS Synth. Biol. – 2019. – Vol. 8, N 12. – P. 2666‒2678. https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00018

19. Xu, S. Optimization of campesterol-producing yeast strains as a feasible platform for the functional reconstitution of plant membrane-bound enzymes / S. Xu, X. Teng, Y. Li // ACS Synth. Biol. – 2023. – Vol. 12, N 4. – P. 1109‒1118. https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00599

20. Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices / S. F. Altschul [et al.] // FEBS J. – 2005. – Vol. 272, N 20. – P. 5101‒5109. https://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2005.04945.x

21. Production of isoamyl acetate in acka-pta and/or ldh mutants of Escherichia coli with overexpression of yeast ATF2 / R. V. Vadali [et al.] //Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – Vol. 63, N 6. – P. 698‒704. https://doi.org/10.1007/s00253-003-1452-y

22. Effect of aeration and unsaturated fatty acids on expression of the Saccharomyces cerevisiae alcohol acetyltransferase gene / T. Fujii [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – Vol. 63, N 3. – P. 910‒915. https://doi.org/10.1128/aem.63.3.910-915.1997

23. Expression of human liver cytochrome P450 IIIA4 in yeast. A functional model for the hepatic enzyme / J. Renaud [et al.] // Eur. J. Biochem. – 1990. – Vol. 194, N 3. – P. 889‒896. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1990.tb19483.x

24. Yuan, J. Engineering the leucine biosynthetic pathway for isoamyl alcohol overproduction in Saccharomyces cerevisiae / J. Yuan, P. Mishra, C. B. Ching // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2017. – Vol. 44, N 1. – P. 107‒117. https://doi.org/10.1007/s10295-016-1855-2

25. Corticosteroid biosynthesis revisited: no direct hydroxylation of pregnenolone by steroid 21-hydroxylase / S. Loke [et al.] // Front. Endocrinol. (Lausanne). – 2021. – Vol. 12. – Art. 633785. https://doi.org/10.3389/fendo.2021.633785

26. A novel cholesterol-producing Pichia pastoris strain is an ideal host for functional expression of human Na,K-ATPase α3β1 isoform / M. Hirz [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2013. – Vol. 97, N 21. – P. 9465‒9478. https://doi.org/10.1007/s00253-013-5156-7

27. Screening of native yeast from Agave duranguensis fermentation for isoamyl acetate production / G. Hernández-Carbajal [et al.] // Braz. Arch. Biol. Technol. – 2013. – Vol. 56, N 3. – P. 357‒363. https://doi.org/10.1590/S1516-89132013000300002

28. Ehmer, P. B. Development of a simple and rapid assay for the evaluation of inhibitors of human 17a-hydroxylase-C17,20-lyase (P450cl7) by coexpression of P450cl7 with NADPH-cytochrome-P450-reductase in Escherichia coli / P. B. Ehmer, J. Jose, R. W. Hartmann // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2000. – Vol. 75, N 1. – P. 57‒63. https://doi.org/10.1016/s0960-0760(00)00137-0

29. Barnes, H. J. Expression and enzymatic activity of recombinant cytochrome P450 17 alpha-hydroxylase in Escherichia coli / H. J. Barnes, M. P. Arlotto, M. R. Waterman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1991. – Vol. 88, N 13. – P. 5597‒5601. https://doi.org/.1073/pnas.88.13.5597

30. De novo progesterone synthesis in plants [Electronic resource] / R. Li [et al.] // bioRxiv. – 2023. – Mode of access: https://doi.org/10.1101/2023.07.19.549634. – Date of access: 31.05.2024.

31. Prostate cancer androgen biosynthesis relies solely on CYP17A1 downstream metabolites / G. Snaterse [et al.] // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 2024. – Vol. 236. – Art. 106446. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2023.106446

32. Cellular pregnenolone esterification by acyl-CoA:cholesterol acyltransferase / M. A. Rogers [et al.] // J. Biol. Chem. – 2012. – Vol. 287, N 21. – P. 17483‒17492. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.331306

33. A critical role for the histidine residues in the catalytic function of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase catalysis: evidence for catalytic difference between ACAT1 and ACAT2 / S. An [et al.] // FEBS Lett. – 2006. – Vol. 580, N 11. – P. 2741–2749. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2006.04.035

34. Inhibitors of enzymes of androgen biosynthesis: cytochrome P45017α and 5α-steroid reductase / M. Jarman [et al.] // Nat. Prod. Reports. – 1998. – Vol. 15, N 5. – P. 495‒512. https://doi.org/10.1039/A815495Y

35. Differential induction of C6 glioma apoptosis and autophagy by 3β-hydroxysteroid-indolamine conjugates / J. Panada [et al.] // Steroids. – 2023. – Vol. 200. – Art. 109326. https://doi.org/10.1016/j.steroids.2023.109326