Роль дисульфидных связей в формировании пространственной структуры эпидермального фактора роста человека

Эпидермальный фактор роста (EGF) – пептид семейства EGF-подобных факторов роста с общим консервативным EGF-подобным доменом, формируемым тремя внутримолекулярными дисульфидными связями. В данной работе описаны изменения в пространственной структуре EGF и его мутантной форме с заменой D46G в C-концевом фрагменте, наблюдаемые при восстановлении дисульфидных связей соответствующих синтетических пептидов в 0,01 М фосфатном буфере (рН = 7,4). Для анализа структуры использовались спектроскопия кругового дихроизма, спектрофлуориметрия, нативный электрофорез в полиакриламидном геле, центрифужная ультрафильтрация. Показано, что восстановление дисульфидных связей изменяет геометрию EGF-подобного домена в сторону увеличения содержания бета-структуры при сохранении димерной формы пептидов. Согласно результатам молекулярного моделирования, при этом может произойти удлинение главной бета-шпильки EGF-подобного домена, межмолекулярной бета-структуры или образование новой бета-структуры между N- и C-концевым фрагментами молекулы, что изменит поверхность межмолекулярного контакта в составе димера. Доказано, что восстановление дисульфидных связей препятствует диссоциации димеров EGF до мономеров. В физиологических условиях это может привести к неспособности EGF формировать сайты связывания с рецептором EGFR и вызывать его активацию.

1. Carpenter, G. Epidermal growth factor / G. Carpenter, S. Cohen // Ann. Rev. Biochem. – 1979. – Vol. 48. – P. 193–216. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.48.070179.001205

2. Evolution of distinct EGF domains with specific functions / M. A. Wouters [et al.] // Protein Sci. – 2005. – Vol. 14, N 4. – P. 1091–1103. https://doi.org/10.1110/ps.041207005

3. Crystal structure of human epidermal growth factor and its dimerization / H. S. Lu [et al.] // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, N 37. – P. 34913–34917. https://doi.org/10.1074/jbc.M102874200

4. Equilibrium between dimeric and monomeric forms of human epidermal growth factor is shifted towards dimers in a solution / A. A. Akunevich [et al.] // Protein J. – 2022. – Vol. 41, N 2. – P. 245–259. https://doi.org/10.1007/s10930-022-10051-y

5. Wieduwilt, M. J. The epidermal growth factor receptor family: biology driving targeted therapeutics / M. J. Wieduwilt, M. M. Moasser // Cell. Mol. Life Sci. – 2008. – Vol. 65, N 10. – P. 1566–1584. https://doi.org/10.1007/s00018-008-7440-8

6. Zhang, A. Improved anti-cancer effect of epidermal growth factor-gold nanoparticle conjugates by protein orientation through site-specific mutagenesis / A. Zhang, J. Nakanishi // Sci. Technol. Adv. Mater. – 2021. – Vol. 22, N 1. – P. 616–626. https://doi.org/10.1080/14686996.2021.1944783

7. Efficacy and safety of recombinant human epidermal growth factor for diabetic foot ulcers: A systematic review and metaanalysis of randomised controlled trials / D. Y. Zhao [et al.] // Int. Wound J. – 2020. – Vol. 17, N 4. – P. 1062–1073. https://doi.org/10.1111/iwj.13377

8. Tombling, B. J. EGF-like and other disulfide-rich microdomains as therapeutic scaffolds / B. J. Tombling, C. K. Wang, D. J. Craik // Angewandte Chem. Int. Ed. – 2020. – Vol. 59, N 28. – P. 11218–11232. https://doi.org/10.1002/anie.201913809

9. Robinson, P. J. Mechanisms of disulfide bond formation in nascent polypeptides entering the secretory pathway / P. J. Robinson, N. J. Bulleid // Cells. – 2020. – Vol. 9, N 1994. – P. 1–13. https://doi.org/10.3390/cells9091994

10. Мартинович, Г. Г. Окислительно-восстановительные процессы в клетках / Г. Г. Мартинович, С. Н. Черенкевич. – Минск : БГУ, 2008. – 159 с.

11. Imbalance of heterologous protein folding and disulfide bond formation rates yields runaway oxidative stress / K. E. Tyo [et al.] // BMC Biol. – 2012. – Vol. 10. – Art. 16. https://doi.org/10.1186/1741-7007-10-16

12. Pérez-Torres, I. Reductive stress in inflammation-associated diseases and the pro-oxidant effect of antioxidant agents / I. Pérez-Torres, V. Guarner-Lans, M. E. Rubio-Ruiz // Int. J. Mol. Sci. – 2017. – Vol. 18, N 10. – Art. 2098. https://doi.org/10.3390/ijms18102098

13. Case report: Biochemical and clinical phenotypes caused by cysteine substitutions in the epidermal growth factor-like domains of fibrillin-1 / X. Liu [et al.] // Front. Gen. – 2022. – Vol. 13. – Art. 928683. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.928683

14. Unique disulfide bonds in epidermal growth factor (EGF) domains of β3 affect structure and function of αIIbβ3 and αvβ3 integrins in different manner / R. Mor-Cohen [et al.] // J. Biol. Chem. – 2012. – Vol. 287, N 12. – P. 8879–8891. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.311043

15. Trans-reduction of cerebral small vessel disease proteins by notch-derived EGF-like sequences / N. M. P. Cartee [et al.] // Int. J. Mol. Sci. – 2022. – Vol. 23, N 3671. – P. 1–15. https://doi.org/10.3390/ijms23073671

16. Recombinant human epidermal growth factor inclusion body solubilization and refolding at large scale using expandedbed adsorption chromatography from Escherichia coli / K. Sharma [et al.] // Protein Expression and Purification. – 2008. – Vol. 60, N 1. – P. 7–14. https://doi.org/10.1016/j.pep.2008.02.020

17. BeStSel: a web server for accurate protein secondary structure prediction and fold recognition from the circular dichroism spectra / A. Micsonai [et al.] // Nucl. Acids Res. – 2018. – N 46. – P. 315–322. https://doi.org/10.1093/nar/gky497

18. Wittig, I. Blue native PAGE / I. Wittig, H. P. Braun, H. Schägger // Nat. Protocols. – 2006. – Vol. 1, N 1. – P. 418–428. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.62

19. Cytochrome c polymerization by successive domain swapping at the C-terminal helix / S. Hirota [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. – 2010. – Vol. 107, N 29. – P. 12854–12859. https://doi.org/10.1073/pnas.1001839107

20. Kozlowski, L. P. IPC 2.0: prediction of isoelectric point and pKa dissociation constants / L. P. Kozlowski // Nucl. Acids Res. – 2021. – Vol. 49, N 1. – P. 285–292. https://doi.org/10.1093/nar/gkab295

21. Chevallet, M. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels / M. Chevallet, S. Luche, T. Rabilloud // Nat. Protocols. – 2006. – Vol. 1, N 4. – P. 1852–1858. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.288

22. Yang, J. I-TASSER server: new development for protein structure and function predictions / J. Yang, Y. Zhang // Nucl. Acids Res. – 2015. – N 43. – Р. 174–181. https://doi.org/10.1093/nar/gkv342

23. Deng, H. 3DRobot: automated generation of diverse and well-packed protein structure decoys / H. Deng, Y. Jia, Y. Zhang // Bioinformatics. – 2016. – Vol. 32 (3). – Р. 378–387. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv601

24. HexServer: an FFT-based protein docking server powered by graphics processors / G. Macindoe [et al.] // Nucl. Acids Res. – 2010. – N 38. – P. 445–449. https://doi.org/10.1093/nar/gkq311

25. Spectra of tryptophan fluorescence are the result of co-existence of certain most abundant stabilized excited state and certain most abundant destabilized excited state / V. V. Khrustalev [et al.] // Spectrochimica Acta, Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. – 2021. – Vol. 257, art. 119784. https://doi.org/10.1016/j.saa.2021.119784

26. Lakowicz, J. Principles of fluorescence spectroscopy / J. Lakowicz. – New York : Springer, 2006. – 954 p.

27. Акуневич, А. А. Оценка последствий восстановления дисульфидных связей на расположение ароматических аминокислотных остатков в третичной структуре эпидермального фактора роста человека / А. А. Акуневич, В. В. Хрусталёв, Т. А. Хрусталёва // Современные достижения химико-биологических наук в профилактической и клинической медицине : сб. науч. тр. 2-й Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Санкт-Петербург, 2–3 дек. 2021 г. / Сев.Зап. гос. мед. ун-т им. И. И. Мечникова ; ред. Л. Б. Гайковая [и др]. – СПб., 2021. – С. 21–28.