Оценка генетической стабильности рекомбинантных векторов гриппа, кодирующих белки Mycobacterium bovis, с помощью ОТ-ПЦР и оптимизация условий их культивирования

Профилактика туберкулеза крупного рогатого скота путем иммунизации традиционными вакцинами и регулярное диагностирование долгое время были основными методами борьбы против данной инфекции. Однако степень защиты от туберкулеза, обеспечиваемая традиционной вакциной БЦЖ, варьируется, и на сегодняшний день причины успешного или неудачного ее применения не ясны. Следовательно, разработка альтернативных безопасных вакцин с более высокой и устойчивой защитой, чем у вакцины БЦЖ, является актуальной. В то же время в основе любой новой вакцины или стратегии вакцинации лежит, как правило, технология изготовления и применения вакцины БЦЖ. Разработанные на основе гриппозных векторов рекомбинантные векторные вакцины показывают большой потенциал и преимущества в обеспечении специфического иммунного ответа.
Цель исследования – оценка ростовых свойств сконструированных рекомбинантных штаммов вируса гриппа, экспрессирующих протективные белки микобактерии, для дальнейшего их использования при создании векторной вакцины против туберкулеза крупного рогатого скота.
В статье представлены результаты работы по культивированию и репродукции рекомбинантных штаммов вируса гриппа. Методами обратной генетики были сконструированы рекомбинантные штаммы вируса гриппа, несущие микобактериальные белки Mycobacterium bovis ESAT-6 и ТB10.4, в последовательности гена NS. По результатам проведенных работ определены оптимальные условия культивирования рекомбинантных штаммов вируса гриппа. Оба варианта рекомбинантного штамма показали репродуктивную активность в системе развивающихся куриных эмбрионов при оптимальных условиях культивирования.
Оценка с помощью метода ОТ-ПЦР генетической стабильности вставки микобактериальных белков в NS ген вируса гриппа показала, что сегмент гена NS содержит вставку микобактериальных белков TB10.4 и ESAT-6, которая сохраняется на протяжении исследованных пяти пассажей.

1. A review on bovine tuberculosis in India / A. K. Refaya [et al.] // Tuberculosis. – 2020. – Vol. 122. – Art. 101923. https://doi.org/10.1016/j.tube.2020.101923

2. Bovine tuberculosis in domestic pigs: Genotyping and distribution of isolates in Argentina / S. Barandiaran [et al.] // Res. Vet. Sci. – 2015. – Vol. 103. – P. 44–50. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.09.013

3. Evaluation of five serologic assays for bovine tuberculosis surveillance in domestic free-range pigs from southern Spain / F. Cardoso-Toset [et al.] // Prev. Vet. Med. – 2017. – Vol. 137. – Pt. A. – P. 101–104. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2016.12.016

4. Good, M. Perspectives on the History of Bovine TB and the Role of Tuberculin in Bovine TB Eradication / M. Good, A. Duignan // Vet. Med. Int. – 2011. – Vol. 2011. – Art. 410470. https://doi.org/10.4061/2011/410470

5. Zoonotic Mycobacterium bovis-induced tuberculosis in humans / B. Muller [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 2013. – Vol. 19, N 6. – P. 899–908. https://doi.org/10.3201/eid1906.120543

6. Zoonotic tuberculosis due to Mycobacterium bovis in developing countries / O. Cosivi [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 1998. – Vol. 4, N 1. – P. 59–70. https://doi.org/10.3201/eid0401.980108

7. Buddle, B. M. Advances in ante-mortem diagnosis of tuberculosis in cattle / B. M. Buddle, P. G. Livingstone, G. W. de Lisle // NZ Vet. J. – 2009. – Vol. 57, N 4. – P. 173–180. https://doi.org/10.1080/00480169.2009.36899

8. Конструирование векторной вакцины на основе холодо-адаптированного вируса гриппа для защиты от бактериальной инфекции, вызываемой стрептококками группы В / Т. А. Смолоногина [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2019. – T. 37, № 1. – C. 25–34.

9. de Vries, R. D. Viral vector-based influenza vaccines / R. D. de Vries, G. F. Rimmelzwaan // Hum. Vaccines Immunother. – 2016. – Vol. 12, N 11. – P. 2881–2901. https://doi.org/10.1080/21645515.2016.1210729

10. Tripp, R. A. Virus-vectored influenza virus vaccines / R. A. Tripp, S. M. Tompkins // Viruses. – 2014. – Vol. 6, N 8. – P. 3055–3079. https://doi.org/10.3390/v6083055

11. Generation of an Influenza A Virus Vector Expressing Biologically Active Human Interleukin-2 from the NS Gene Segment / C. Kittel [et al.] // J. Virol. – 2005. – Vol. 79, N 16. – P. 10672–10677. https://doi.org/10.1128/jvi.79.16.10672-10677.2005

12. Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60 / H. Jin [et al.] // Virology. – 2003. – Vol. 306, N 1. – P. 18–24. https://doi.org/10.1016/s0042-6822(02)00035-1

13. Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in mice / B. Ferko [et al.] // Virology. – 2001. – Vol. 75, N 19. – P. 8899–8908. https://doi.org/10.1128/jvi.75.19.8899-8908.2001

14. Intranasal inoculation of a recombinant influenza virus containing exogenous nucleotides in the NS segment induces mucosal immune response against the exogenous gene product in mice / N. Takasuka [et al.] // Vaccine. – 2002. – Vol. 20, N 11–12. – P. 1579–1585. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(01)00491-1

15. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells / A. Egorov [et al.] // J. Virol. – 1998 – Vol. 72, N 8. – P. 6437–6441. https://doi.org/10.1128/JVI.72.8.6437-6441.1998

16. Influenza Viral Vectors Expressing Two Kinds of HA Proteins as Bivalent Vaccine Against Highly Pathogenic Avian Influenza Viruses of Clade 2.3.4.4 H5 and H7N9 / J. Li [et al.] // Front Microbiol. – 2018. – Vol. 9. – Art. 604. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00604

17. Король, О. И. Туберкулез у детей и возможности его предупреждения / О. И. Король // Туберкулез: проблемы диагностики, лечения и профилактики: тр. Всерос. науч.-практ. конф., 13–14 нояб. 2003 г. / под ред. Ю. Н. Левашева. – СПб., 2003. – С. 100–104.

18. Медуницын, Н. В. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней : учеб. пособие / Н. В. Медуницын, В. И. Покровский. – М. : Геотар-Медиа, 2005. – 528 с.

19. Identification of Novel Mycobacterium bovis Antigens by Dissection of Crude Protein Fractions / V. Meike [et al.] // Clin. Vaccine Immunol. – 2009. – Vol. 16, N 9. – P. 1352–1359. https://doi.org/10.1128/cvi.00211-09

20. Pollock, J. M. The potential of the ESAT-6 antigen secreted by virulent mycobacteria for specific diagnosis of tuberculosis / J. M. Pollock, P. Andersen // J. Infect. Dis. – 1997. – Vol. 175, N 5. – P. 1251–1254. https://doi.org/10.1086/593686

21. Immune responses and protective efficacy of the gene vaccine expressing Ag85B and ESAT6 fusion protein from Mycobacterium tuberculosis / Sh. Chang-hong [et al.] // DNA Cell Biol. – 2008. – Vol. 27, N 4. – P. 199–207. https://doi.org/10.1089/dna.2007.0648