Биосинтез аденозиндезаминазы Escherichia coli в системе бесклеточного синтеза белка

Одним из новых перспективных направлений молекулярной биотехнологии является бесклеточный синтез белка (БСБ). Процедура БСБ основана на реконструкции in vitro всех этапов биосинтеза белка в клетке, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами.

Ранее нами был сконструирован штамм Escherichia coli, продуцирующий гомологичную аденозиндезаминазу (АДазу). B настоящем исследовании в качестве варианта, альтернативного каноническому глубинному культивированию в ферментере, была изучена возможность синтеза АДазы в системе БСБ. Для синтеза этого фермента использовали SSO-клеточный экстракт E. coli, РНК-полимеразу бактериофага Т7 и высококопийный плазмидный вектор pET42mut со встроенным в него геном АДазы.

B результате выполнения работы нами впервые продемонстрирована возможность синтеза АДазы E. coli в системе БСБ. B частично оптимизированных условиях проведения процесса получен экспериментальный образец рекомбинантной АДазы с активностью 530 Ед/мл ферментного препарата.

1. The incorporation of the A2 protein to produce novel Qe virus-like particles using cell-free protein synthesis / M.T. Smith [et al.] // Biotechnol. Progr. - 2012. - Vol. 28, N 2. - P. 549-555. https://doi.org/10.1002/btpr.744

2. De novo expression and antibacterial potential of four lactoferricin peptides in cell-free protein synthesis system / N. El-Baky [et al.] // Biotechnol. Rep. - 2020. - Vol. 29. - Art. e00590. https://doi.org/10.1016/j.btre.2020.e00583

3. Cell-free synthesis of functional aquaporin Z in synthetic liposomes / N. T. Hovijitra [et al.] // Biotechnol. Bioeng. -2009. - Vol. 104, N 1. - P. 40-49. https://doi.org/10.1002/bit.22385

4. Patel, K. G. Surface functionalization of virus-like particles by direct conjugation using azide-alkyne click chemistry / K. G. Patel, J. R. Swartz // Biocon. Chem. - 2011. - Vol. 22, N 3. - P. 376-387. https://doi.org/10.1021/bc100367u

5. In vitro production of perdeuterated proteins in H2O for biomolecular NRM studies / L. Imbert [et al.] // Meth. Mol. Biol. - 2021. - Vol. 2199. - P. 127-149. https://doi.org/10.10207/978-1-0716-0892-0_8

6. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode / V. Georgi [et al.] // Lab. Chip. - 2016. - Vol. 16, N 2. - P. 269-281. https://doi.org/10.1039/C5LC00700C

7. Cell-free protein synthesis: The transition from batch reactions to minimal cells and microfluidic devices / M. H. Ayoubi-Joshaghani [et al.] // Biotechnol. Bioengin. - 2020. - Vol. 117, N 4. - P. 1204-1229. https://doi.org/10.1002/bit.27248

8. Zubay, G. In vitro synthesis of protein in microbial systems / G. Zubay // Annu. Rev. Genet. - 1973. - Vol. 7. - P. 267-287. https://doi.org/10.1146/annurev.ge.07.120173.00141 1

9. Assessing sequence plasticity of a virus-like nanoparticle by evolution toward a versatile scaffold for vaccines and drug delivery / Y. Lu [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2015. - Vol. 112. - P. 12360-12365. https://doi.org/10.1073/pnas.1510533112

10. Production of bispecific antibodies in “knobs-into holes” using a cell-free expression system / Y. Xu [et al.] // mAbs. -2015. - Vol. 7, N 1. - P. 231-242. https://doi.org/10.4161/19420862.2015.989013

11. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production a new approach for shortening protein production development timelines / J. F. Zawada [et al.] // Biotechnol. Bioeng. - 2011. - Vol. 108, N 7. - P. 1570-1578. https://doi.org/10.1002/bit.23103

12. Guo, W. Mini-review: in vitro metabolic engineering for biomanufacturing of high-value products / W. Guo, J. Sheng, X. Feng // Comput. Struct. Biotechnol. J. - 2017. - Vol. 15. - P. 161-167. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2017.01.006

13. A cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRe-specific endocrine disruptors / A. S. Salehi [et al.] // Anal. Chem. - 2017. - Vol. 89, N 6. - P. 3395-3401. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b04034

14. Paper-based synthetic gene networks / K. Pardee [et al.] // Cell. - 2014. - Vol. 159, N 4. - P. 940-954. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.10.004

15. Tonooka, T. Microfluidic device with integrated freeze-dried cell-free protein synthesis system for small-volume biosensing / T. Tonooka // Micromachines. - 2020. - Vol. 12. - P. 27-37. https://doi.org/10.3390/mi12010027

16. Enzymatic synthesis of 2'-deoxyguanosine with nucleoside deoxyribosyltransferase-II / K. Okuyama [et al.] // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2003. - Vol. 67, N 5. - P. 989-995. https://doi.org/10.1271/bbb.67.989

17. Казловский, И. C. Модификация экспрессионной pET-системы для использования в бесклеточном синтезе белка / И. C. Казловский, А. Н. Рымко, А. И. Зинченко // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты : еб. науч. тр. / Ин-т микробиологии НАН Беларуси. - Минск, 2018. - Т. 10. - C. 69-78.

18. Production of thermostable DNA polymerase suitable for whole-blood polymerase chain reaction / A. S. Korovashkina [et al.] // Biochemistry and Biotechnology: Research and Development / eds. : S. D. Varfolomeev, G. E. Zaikov, L. P. Krylova. -New York, 2012. - Р. 1-6.

19. You, C. Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis / C. You, X. Z. Zhang, Y. H. P. Zhang // Appl. Environ. Microbiol. - 2012. - Vol. 78, N 5. - P. 1593-1595. https://doi.org/10.1128/AEM.07105-11

20. Квач, C. В. Оптимизация условий экспрессии штамма-суперпродуцента аденозиндезаминазы Escherichia coli / C. В. Квач, Л. А. Ерошевская, А. И. Зинченко // Динамика исследований - 2008: материалы IV Междунар. науч.-практ. конф., C<><|)nsf. 16-31 июля 2008 г. - C<><|)nsf. 2008. - C. 26-29.