vestibИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Biological Series1029-89402524-230XThe Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1029-8940-2023-68-2-104-113vestib-867Research ArticleСтатьиПолучение экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность гена, кодирующего белок Bet v 1 – основной аллерген пыльцы березыObtaining an expression vector containing the nucleotide sequence of the gene encoding Bet v 1 – the major allergen of birch pollenhttps://orcid.org/0000-0003-3984-393XПархомчукО. Ю.ParkhomchukO. Yu.

Пархомчук Ольга Юрьевна – аспирант, мл. науч.сотрудник

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Olga Yu. Parkhomchuk – Postgraduate student, JuniorResearcher

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

olgaparhom4uk@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3028-1176ФоминаЕ. Г.FominaE. G.

Фомина Елена Георгиевна – д-р биол. наук, заведующий лабораторией

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Elena G. Fomina – D. Sc. (Biol.), Head of the Laboratory

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

feg1@tut.byhttps://orcid.org/0000-0003-3919-0625ГригорьеваЕ. Е.GrigorievaE. E.

Григорьева Елена Евгеньевна – канд. биол. наук,доцент, вед. науч. сотрудник

ул. Филимонова, 23, 220114, г. Минск

Elena E. Grigorieva – Ph. D. (Biol.), Associate Professor, Leading Researcher

23, Filimonov Str., 220114, Minsk

grigus@mail.ruРеспубликанский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологииRepublican Scientific and Practical Center of Epidemiology and Microbiology202304052023682104113Copyright © Пархомчук О.Ю., Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е., 20232023Пархомчук О.Ю., Фомина Е.Г., Григорьева Е.Е.Parkhomchuk O.Y., Fomina E.G., Grigorieva E.E.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestibio.belnauka.by/jour/article/view/867

Создана экспрессирующая векторная конструкция, содержащая ген, кодирующий наиболее распространенную изоформу Bet v 1.0101 белка Bet v 1 – главного аллергена пыльцы березы, для последующей экспрессии белка в прокариотической системе Escherichia coli. В качестве матрицы использована тотальная РНК пыльцы березы повислой, собранной на территории Республики Беларусь. Получение экспрессирующего вектора pJC40-Веt v 1 осуществлялось при помощи молекулярно-генетических методов: клонирования, лигирования, трансформации. Специфичность клонированного фрагмента подтверждалась методом секвенирования. В ходе исследования в кодирующей части клонированного гена установлено 14 редких для Escherichia coli кодонов. Триплеты расположены в нуклеотидной последовательности равномерно, кластеризация кодонов наблюдалась только в двух случаях. Общее процентное содержание редких триплетов (8,75 %) и рассчитанное значение уровня адаптации кодонов (0,57) позволяет прогнозировать достаточно эффективную экспрессию исследуемого гена. 

An expression vector containing the gene encoding the most common isoform Bet v 1.0101 of the Bet v 1 protein, the major birch pollen allergen, was created for a subsequent expression in the prokaryotic system of Escherichia coli. Total RNA from birch pollen collected in Belarus was used as a matrix. The expression vector pJC40-Веt v 1 was obtained using molecular-genetic methods: cloning, ligation, transformation. The specificity of the cloned fragment was confirmed by sequencing. During the study, 14 rare Escherichia coli codons were identified in the coding part of the cloned gene. The triplets were evenly arranged in the nucleotide sequence; codon clustering was observed only in two cases. The total percentage of rare triplets (8.75 %) and the calculated value of the codon adaptation level (0.57) allow us to predict a sufficiently efficient expression of the studied gene. The data obtained will be used in the synthesis of the recombinant polypeptide Bet v 1.0101.

pJC40Bet v 1аллергенэкспрессирующий векторрекомбинантный белокpJC40Bet v 1allergenexpressing vectorrecombinant proteinРабота выполнена при финансовой поддержке гранта Президента Республики Беларусь (распоряжение Президента Республики Беларусь от 1 марта 2022 г. № 45рп «О предоставлении грантов Президента Республики Беларусь на 2022 год»).ReferencesProteomic profiling of birch (Betula verrucosa) pollen extracts from different origins / A. Erler [et al.] // Proteomics. – 2011. – Vol. 11, N 8. – P. 1486–1498. https://doi.org/10.1002/pmic.201000624Erler A., Hawranek T., Krückemeier L., Asam C., Egger M., Ferreira F., Briza P. Proteomic profiling of birch (Betula verrucosa) pollen extracts from different origins. Proteomics, 2011, vol. 11, no. 8, pp. 1486–1498. https://doi.org/10.1002/ pmic.201000624Comparative proteomics of common allergenic tree pollens of birch, alder, and hazel / B. Darnhofer [et al.] // Allergy. – 2021. – Vol. 76, N 6. – P. 1743–1753. https://doi.org/10.1111/all.14694Darnhofer B., Tomin T., Liesinger L., Schittmayer M., Tomazic P. V., Birner-Gruenberger R. Comparative proteomics of common allergenic tree pollens of birch, alder, and hazel. Allergy, 2021, vol. 76, no. 6, pp. 1743–1753. https://doi.org/10.1111/ all.14694Ligand binding of PR-10 proteins with a particular focus on the Bet v 1 allergen family / L. Aglas [et al.] // Curr. Allergy Asthma Rep. – 2020. – Vol. 20, N 7. – P. 25. https://doi.org/10.1007/s11882-020-00918-4Aglas L., Soh W. T., Kraiem A., Wenger M., Brandstetter H., Ferreira F. Ligand binding of PR-10 proteins with a particular focus on the Bet v 1 allergen family. Current Allergy and Asthma Reports, 2020, vol. 20, no. 7, p. 25. https://doi. org/10.1007/s11882-020-00918-4Molecular aspects of allergens and allergy / R. Valenta [et al.] // Adv. Immunol. – 2018. – Vol. 138. – P. 195–256. https:// doi.org/10.1016/bs.ai.2018.03.002Valenta R., Karaulov A., Niederberger V., Gattinger P., van Hage M., Flicker S. [et al.]. Molecular aspects of allergens and allergy. Advances in Immunology, 2018, vol. 138, pp. 195–256. https://doi.org/10.1016/bs.ai.2018.03.002PR-белки с рибонуклеазной активностью и устойчивостью растений к патогенным грибам / Е. А. Филипенко [и др.] // Вавилов. журн. генетики и селекции. – 2013. – Т. 17, № 2. – С. 326–334.Filipenko E. A., Kochetov A. V., Kanayama Y., Malinovskii V. I., Shumnyi V. K. Association between PR proteins with ribonuclease activity and plant resistance against pathogenic fungi. Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii [Vavilov journal of genetics and breeding], 2013, vol. 17, no. 2, pp. 326–334 (in Russian).Conformational flexibility differentiates naturally occurring Bet v 1 isoforms / S. Grutsch [et al.] // Int. J. Mol. Sci. – 2017. – Vol. 18, N 6. – Art. 1192. https://doi.org/10.3390/ijms18061192Grutsch S., Fuchs J. E., Ahammer L., Kamenik A. S., Liedl K. R., Tollinger M. Conformational flexibility differentiates naturally occurring Bet v 1 isoforms. International Journal of Molecular Sciences, 2017, vol. 18, no. 6, art. 1192. https:// doi.org/10.3390/ijms18061192Proteomic analysis of the major birch allergen Bet v 1 predicts allergenicity for 15 birch species / M. F. Schenk [et al.] // J. Proteomics. – 2011. – Vol. 74, N 8. – P. 1290–1300. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2011.03.021Schenk M. F., Cordewener J. H., America A. H., Peters J., Smulders M. J., Gilissen L. J. Proteomic analysis of the major birch allergen Bet v 1 predicts allergenicity for 15 birch species. Journal of Proteomics, 2011, vol. 74, no. 8, pp. 1290– 1300. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2011.03.0218Allergen Nomenclature [Electronic resource]. – Mode of access: http://www.allergen.org/index.php. – Date of access: 30.09.2022.Allergen Nomenclature. Available at: http://www.allergen.org/index.php (accessed 30.09.2022).Tree pollen allergens-an update from a molecular perspective / C. Asam [et al.] // Allergy. – 2015. – Vol. 70, N 10. – P. 1201–1211. https://doi.org/10.1111/all.12696Asam C., Hofer H., Wolf M., Aglas L., Wallner M. Tree pollen allergens-an update from a molecular perspective. Allergy, 2015, vol. 70, no. 10, pp. 1201–1211. https://doi.org/10.1111/all.12696Ligand recognition of the major birch pollen allergen Bet v 1 is isoform dependent / C. Seutter von Loetzen [et al.] // PLoS ONE. – 2015. – Vol. 10, N 6. – P. e0128677. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0128677Seutter von Loetzen C., Jacob T., Hartl-Spiegelhauer O., Vogel L., Schiller D., Spörlein-Güttler C., Schobert R., Vieths S., Hartl M. J., Rösch P. Ligand recognition of the major birch pollen allergen Bet v 1 is isoform dependent. PLoS ONE, 2015, vol. 10, no. 6, p. e0128677. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0128677Valenta, R. Recombinant allergy vaccines based on allergen-derived B cell epitopes / R. Valenta, R. Campana, V. Niederberger // Immunol. Lett. – 2017. – Vol. 189. – P. 19–26. https://doi.org/10.1016/j.imlet.2017.04.015Valenta R., Campana R., Niederberger V. Recombinant allergy vaccines based on allergen-derived B cell epitopes. Immunology Letters, 2017, vol. 189, pp. 19–26. https://doi.org/10.1016/j.imlet.2017.04.015Мировые стандарты аллерген-специфической иммунотерапии. Научный обзор [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.allergen.ru/images/staloral_10.pdf. – Дата доступа: 30.09.2022.World standards of allergen-specific immunotherapy. Scientific review. Available at: http://www.allergen.ru/images/ staloral_10.pdf (accessed 30.09.2022) (in Russian).111 years of allergen-immunotherapy: A long and successful history of the only available disease-modifier in allergic diseases / J. Gutermuth [et al.] // Allerg. Select. – 2022. – Vol. 6, N 1. – P. 248–258. https://doi.org/10.5414/ALX02330EGutermuth J., Grosber M., Pfaar O., Bergmann K. C., Ring J. 111 years of allergen-immunotherapy: A long and successful history of the only available disease-modifier in allergic diseases. Allergologie Select, 2022, vol. 6, no. 1, pp. 248–258. https://doi.org/10.5414/ALX02330EBirch pollen allergy in Europe / T. Biedermann [et al.] // Allergy. – 2019. – Vol. 74, N 7. – P. 1237–1248. https://doi. org/10.1111/all.13758Biedermann T., Winther L., Till S. J., Panzner P., Knulst A., Valovirta E. Birch pollen allergy in Europe. Allergy, 2019, vol. 74, no. 7, pp. 1237–1248. https://doi.org/10.1111/all.13758Recombinant allergens for immunotherapy: state of the art / Y. Zhernov [et al.] // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. – 2019. – Vol. 19, N 4. – P. 402–414. https://doi.org/10.1097/ACI.0000000000000536Zhernov Y., Curin M., Khaitov M., Karaulov A., Valenta R. Recombinant allergens for immunotherapy: state of the art. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology, 2019, vol. 19, no. 4, pp. 402–414. https://doi.org/10.1097/ ACI.0000000000000536Epitope specificity determines cross-protection of a AIT-induced IgG4 antibody / E. Gadermaier [et al.] // Allergy. – 2016. – Vol. 71, N 1. – P. 36–46. https://doi.org/10.1111/all.12710Gadermaier E., James L. K., Shamji M. H., Blatt K., Fauland K., Zieglmayer P. [et al.]. Epitope specificity determines cross-protection of a SIT-induced IgG4 antibody. Allergy, 2016, vol. 71, no. 1, pp. 36–46. https://doi.org/10.1111/all.12710Tscheppe, A. Recombinant allergens in structural biology, diagnosis, and immunotherapy / A. Tscheppe, H. Breiteneder // Int. Arch. Allergy Immunol. – 2017. – Vol. 172, N 4. – P. 187–202. https://doi.org/10.1159/000464104 112Tscheppe A., Breiteneder H. Recombinant allergens in structural biology, diagnosis, and immunotherapy. International Archives of Allergy and Immunology, 2017, vol. 172, no. 4, pp. 187–202. https://doi.org/10.1159/000464104Isolation of total RNA from pollens / K. Bijli [et al.] // Preparat. Biochem. Biotechnol. – 2001. – Vol. 31, N 2. – P. 155– 162. https://doi.org/10.1081/PB-100103381Bijli K. M., Singh B. P., Sridhara S., Arora N. Isolation of total RNA from pollens. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2001, vol. 31, no. 2, pp. 155–162. https://doi.org/10.1081/PB-100103381Clos, J. pJC20 and pJC40 − two high-copy-number vectors for T7 RNA polymerase-dependent expression of recombinant genes in Escherichia coli / J. Clos, S. Brandau // Protein Expr. Purif. – 1994. – Vol. 5, N 2. – P. 133–137. https://doi. org/10.1006/prep.1994.1020Clos J., Brandau S. pJC20 and pJC40 − two high-copy-number vectors for T7 RNA polymerase-dependent expression of recombinant genes in Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 1994, vol. 5, no. 2, pp. 133–137. https://doi. org/10.1006/prep.1994.1020Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1977. – Vol. 74, N 12. – P. 5463–5467. https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5463Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1977, vol. 74, no. 12, pp. 5463–5467. https://doi.org/10.1073/ pnas.74.12.5463Tripathi, N. K. Recent developments in bioprocessing of recombinant proteins: expression hosts and process development / N. K. Tripathi, A. Shrivastava // Front. Bioeng. Biotechnol. – 2019. – Vol. 7. – Art. 420. https://doi.org/10.3389/ fbioe.2019.00420Tripathi N. K., Shrivastava A. Recent developments in bioprocessing of recombinant proteins: expression hosts and process development. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2019, vol. 7, art. 420. https://doi.org/10.3389/ fbioe.2019.00420Varma, A. Plant genomic DNA isolation: an art or a science / A. Varma, H. Padh, N. Shrivastava // Biotechnol. J. – 2007. – Vol. 2, N 3. – P. 386–392. https://doi.org/10.1002/biot.200600195Varma A., Padh H., Shrivastava N. Plant genomic DNA isolation: an art or a science. Biotechnology Journal, 2007, vol. 2, no. 3, pp. 386–392. https://doi.org/10.1002/biot.200600195Рябушкина, Н. А. Специфика выделения ДНК из растительных обьектов / Н. А. Рябушкина, М. Е. Омашева, Н. Н. Галиакпаров // Биотехнология. Теория и практика. – 2012. – № 2. – С. 9–26.Ryabushkina N. A., Omasheva M. E., Galiakparov N. N. Specifics of DNA extraction from plant objects. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 2012, no. 2, pp. 9–26 (in Russian).Сравнительный анализ двух методов выделения РНК из растительного сырья / О. Ю. Пархомчук [и др.] // Современные проблемы инфекционной патологии человека : сб. науч. тр. / под ред. В. А. Горбунова. – Минск, 2019. – Вып. 12. – С. 237–238.Parkhomchuk O. Yu., Zverko V. V., Grigor’eva E. E., Fomina E. G. Comparative analysis of two methods for RNA isolation from plant raw materials. Sovremennye problemy infektsionnoi patologii cheloveka: sbornik nauchnykh trudov. Vypusk 12 [Modern problems of infectious morbidity in humans: a collection of scientific papers. Iss. 12]. Minsk, 2019, pp. 237–238 (in Russian).Brule, C. Synonymous codons: choose wisely for expression / C. Brule, E. J. Grayhack // Trends Genet. – 2017. – Vol. 33, N 4. – P. 283–297. https://doi.org/10.1016/j.tig.2017.02.001Brule C. E., Grayhack E. J. Synonymous codons: choose wisely for expression. Trends in Genetics, 2017, vol. 33, no. 4, pp. 283–297. https://doi.org/10.1016/j.tig.2017.02.001MolBiol.ru [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.molbiol.ru/scripts/01_11.html. – Дата доступа: 30.09.2022.MolBiol.ru. Available at: http://www.molbiol.ru/scripts/01_11.html (accessed 30.09.2022) (in Russian).Codon Usage Database [Electronic resource]. – Mode of access: http://www.kazusa.or.jp/codon/. – Date of access: 30.09.2022.Codon Usage Database. Available at: http://www.kazusa.or.jp/codon/ (accessed 30.09.2022).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.