vestibИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Biological Series1029-89402524-230XThe Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1029-8940-2023-68-1-38-46vestib-848Research ArticleСтатьиОценка генетической стабильности рекомбинантных векторов гриппа, кодирующих белки Mycobacterium bovis, с помощью ОТ-ПЦР и оптимизация условий их культивированияEvaluation of the genetic stability of recombinant flu vectors encoding Mycobacterium bovis proteins using RT-PCR and optimization of their cultivation conditionsАбайЖ. С.AbayZh. S.

Абай Жандос Сайлаубекулы – магистр естеств. наук, мл. науч. сотрудник

ул. Б. Момышулы, 15, 080409, пгт. Гвардейский

Zhandos S. Abay – Master of Natural Sciences, Junior Researcher

15, Momyshuly Str., 080409, Guardeyskii

abaizh097@mail.ruСадикалиеваС. О.SadikalievaS. O.

Садикалиева Сандугаш Оразбековна – магистр естеств. наук, ст. науч. сотрудник

ул. Б. Момышулы, 15, 080409, пгт. Гвардейский

Sandugash О. Sadikalieva – Master of Natural Sciences, Senior Researcher

15, Momyshuly Str., 080409, Guardeyskii

sadikalieva86@mail.ruШораеваК. А.ShorayevaK. A.

Шораева Камшат Абитхановна – канд. хим. наук, заведующий лабораторией

ул. Б. Момышулы, 15, 080409, пгт. Гвардейский

Kamshat A. Shorayeva – Ph. D. (Chem.), Head of the Laboratory

15, Momyshuly Str., 080409, Guardeyskii

k.a.shorayeva@mail.ruЕспембетовБ. А.EspembetovB. A.

Еспембетов Болат Аманбаевич – канд. ветеринар. наук, профессор, заведующий лабораторией

ул. Б. Момышулы, 15, 080409, пгт. Гвардейский

Bolat A. Espembetov – Ph. D. (Veterinary), Professor, Head of the Laboratory

15, Momyshuly Str., 080409, Guardeyskii

espembetov@mail.ruНурпейсоваА. С.NurpeisovaA. S.

Нурпейсова Айнур Султановна – канд. ветеринар. наук, вед. науч. сотрудник

ул. Б. Момышулы, 15, 080409, пгт. Гвардейский

Ainur S. Nurpeisova – Ph. D. (Veterinary), Leading Researcher

15, Momyshuly Str., 080409, Guardeyskii

ainurnurpeisova@mail.ruНаучно-исследовательский институт проблем биологической безопасностиResearch Institute of Biological Safety Problems2023100220236813846Copyright © Абай Ж.С., Садикалиева С.О., Шораева К.А., Еспембетов Б.А., Нурпейсова А.С., 20232023Абай Ж.С., Садикалиева С.О., Шораева К.А., Еспембетов Б.А., Нурпейсова А.С.Abay Z.S., Sadikalieva S.O., Shorayeva K.A., Espembetov B.A., Nurpeisova A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestibio.belnauka.by/jour/article/view/848

Профилактика туберкулеза крупного рогатого скота путем иммунизации традиционными вакцинами и регулярное диагностирование долгое время были основными методами борьбы против данной инфекции. Однако степень защиты от туберкулеза, обеспечиваемая традиционной вакциной БЦЖ, варьируется, и на сегодняшний день причины успешного или неудачного ее применения не ясны. Следовательно, разработка альтернативных безопасных вакцин с более высокой и устойчивой защитой, чем у вакцины БЦЖ, является актуальной. В то же время в основе любой новой вакцины или стратегии вакцинации лежит, как правило, технология изготовления и применения вакцины БЦЖ. Разработанные на основе гриппозных векторов рекомбинантные векторные вакцины показывают большой потенциал и преимущества в обеспечении специфического иммунного ответа.Цель исследования – оценка ростовых свойств сконструированных рекомбинантных штаммов вируса гриппа, экспрессирующих протективные белки микобактерии, для дальнейшего их использования при создании векторной вакцины против туберкулеза крупного рогатого скота.В статье представлены результаты работы по культивированию и репродукции рекомбинантных штаммов вируса гриппа. Методами обратной генетики были сконструированы рекомбинантные штаммы вируса гриппа, несущие микобактериальные белки Mycobacterium bovis ESAT-6 и ТB10.4, в последовательности гена NS. По результатам проведенных работ определены оптимальные условия культивирования рекомбинантных штаммов вируса гриппа. Оба варианта рекомбинантного штамма показали репродуктивную активность в системе развивающихся куриных эмбрионов при оптимальных условиях культивирования.Оценка с помощью метода ОТ-ПЦР генетической стабильности вставки микобактериальных белков в NS ген вируса гриппа показала, что сегмент гена NS содержит вставку микобактериальных белков TB10.4 и ESAT-6, которая сохраняется на протяжении исследованных пяти пассажей.

Prevention by immunizing cattle against tuberculosis with traditional vaccines and regular testing has long been the main method of controlling this infection. However, the non-specificity of the traditional method shows the need for alternative approaches in the creation of anti-infective vaccines. The development of recombinant vector vaccines based on influenza vectors shows great potential and advantages in providing a specific immune response.The purpose of the study is to evaluate the growth properties of the recombinant influenza virus strains expressing protective proteins of mycobacteria for further use in creating a vector vaccine against bovine tuberculosis.This article presents the results of work on the cultivation and reproduction of recombinant influenza virus strains. Using reverse genetics methods, recombinant strains of the influenza virus carrying the mycobacterial Mycobacterium bovis ESAT-6 and TB10.4 proteins in the NS gene sequence were constructed. Based on the results of the work carried out, the optimal conditions for cultivating recombinant influenza virus strains were determined. Both variants of the recombinant strain showed reproductive activity in the developing chick embryo system, under optimal cultivation conditions.The evaluation of the genetic stability of the insertion of mycobacterial proteins into the NS gene of the influenza virus was confirmed using the RT-PCR method. As a result, it was found that the NS gene segment contains an insertion of mycobacterial proteins TB10.4 and ESAT-6, which is retained throughout the studied 5 passages.

рекомбинантный вирус гриппаэкспрессияMycobacterium bovisкультивированиевекторыгенетическая стабильностьОТ-ПЦРrecombinant influenza virusexpressionMycobacterium boviscultivationvectorsgenetic stabilityRT-PCRРабота выполнена при поддержке Министерства образования и науки Республики Казахстан в рамках грантового проекта № AP09259683 «Разработка технологии изготовления векторной вакцины для профилактики туберкулеза крупного рогатого скота» Министерства образования и науки Республики Казахстан.The work was supported by the Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan within the framework of grant project No. AP09259683 “Development of technology for the manufacture of a vector vaccine for the prevention of tuberculosis in cattle” of the Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan.ReferencesA review on bovine tuberculosis in India / A. K. Refaya [et al.] // Tuberculosis. – 2020. – Vol. 122. – Art. 101923. https://doi.org/10.1016/j.tube.2020.101923Refaya A. K., Bhargavi G., Mathew N. Ch., Rajendran A., Krishnamoorthy R., Swaminathan S., Palaniyandi K. A review on bovine tuberculosis in India. Tuberculosis, 2020, vol. 122, art. 101923. https://doi.org/10.1016/j.tube.2020.101923Bovine tuberculosis in domestic pigs: Genotyping and distribution of isolates in Argentina / S. Barandiaran [et al.] // Res. Vet. Sci. – 2015. – Vol. 103. – P. 44–50. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.09.013Barandiaran S., Martínez Vivot M., Pérez A. M., Cataldi A. A., Zumárraga M. J. Bovine tuberculosis in domestic pigs: Genotyping and distribution of isolates in Argentina. Research in Veterinary Science, 2015, vol. 103, pp. 44–50. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.09.013Evaluation of five serologic assays for bovine tuberculosis surveillance in domestic free-range pigs from southern Spain / F. Cardoso-Toset [et al.] // Prev. Vet. Med. – 2017. – Vol. 137. – Pt. A. – P. 101–104. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2016.12.016Cardoso-Toset F., Luque I., Carrasco L., Jurado-Martos F., Risalde M. A., Venteo A. [et al.]. Evaluation of five serologic assays for bovine tuberculosis surveillance in domestic free-range pigs from southern Spain. Preventive Veterinary Medicine, 2017, vol. 1, no. 137, pt. A, pp. 101–104. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2016.12.016Good, M. Perspectives on the History of Bovine TB and the Role of Tuberculin in Bovine TB Eradication / M. Good, A. Duignan // Vet. Med. Int. – 2011. – Vol. 2011. – Art. 410470. https://doi.org/10.4061/2011/410470Good M., Duignan A. Perspectives on the History of Bovine TB and the Role of Tuberculin in Bovine TB. Veterinary Medicine International, 2011, vol. 2011, art. 410470. https://doi.org/10.4061/2011/410470Zoonotic Mycobacterium bovis-induced tuberculosis in humans / B. Muller [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 2013. – Vol. 19, N 6. – P. 899–908. https://doi.org/10.3201/eid1906.120543Müller B., Dürr S., Alonso S., Hattendorf J., Laisse C. J. M., Parsons S. D. C., van Helden P. D., Zinsstag J. Zoonotic Mycobacterium bovis-induced tuberculosis in humans. Emerging Infectious Diseases, 2013, vol. 19, no. 6, pp. 899–908. https://doi.org/10.3201/eid1906.120543Zoonotic tuberculosis due to Mycobacterium bovis in developing countries / O. Cosivi [et al.] // Emerg. Infect. Dis. – 1998. – Vol. 4, N 1. – P. 59–70. https://doi.org/10.3201/eid0401.980108Cosivi O., Grange J. M., Daborn C. J., Raviglione M. C., Fujikura T., Cousins D. Zoonotic tuberculosis due to Mycobacterium bovis in developing countries. Emerging Infectious Diseases, 1998, vol. 4, no. 1, pp. 59–70. https://doi.org/10.3201/eid0401.980108Buddle, B. M. Advances in ante-mortem diagnosis of tuberculosis in cattle / B. M. Buddle, P. G. Livingstone, G. W. de Lisle // NZ Vet. J. – 2009. – Vol. 57, N 4. – P. 173–180. https://doi.org/10.1080/00480169.2009.36899Buddle B. M., Livingstone P. G., de Lisle G. W. Advances in ante-mortem diagnosis of tuberculosis in cattle. New Zealand Veterinary Journal, 2009, vol. 57, no. 4, pp. 173–180. https://doi.org/10.1080/00480169.2009.36899Конструирование векторной вакцины на основе холодо-адаптированного вируса гриппа для защиты от бактериальной инфекции, вызываемой стрептококками группы В / Т. А. Смолоногина [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2019. – T. 37, № 1. – C. 25–34.Smolonogina T. A., Isakova-Sivak I. N., Kotomina T. S., Evsina A. S., Stepanova E. A., Prokopenko P. I., Leont’eva G. F., Suvorov A. N., Rudenko L. G. Design of a vector vaccine based on a cold-adapted influenza virus to protect against a bacterial infection caused by group B streptococci. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology], 2019, vol. 37, no. 1, pp. 25–34 (in Russian).de Vries, R. D. Viral vector-based influenza vaccines / R. D. de Vries, G. F. Rimmelzwaan // Hum. Vaccines Immunother. – 2016. – Vol. 12, N 11. – P. 2881–2901. https://doi.org/10.1080/21645515.2016.1210729de Vries R. D., Rimmelzwaan G. F. Viral vector-based influenza vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2016, vol. 12, no. 11, pp. 2881–2901. https://doi.org/10.1080/21645515.2016.1210729Tripp, R. A. Virus-vectored influenza virus vaccines / R. A. Tripp, S. M. Tompkins // Viruses. – 2014. – Vol. 6, N 8. – P. 3055–3079. https://doi.org/10.3390/v6083055Tripp R. A., Tompkins S. M. Virus-vectored influenza virus vaccines. Viruses, 2014, vol. 6, no. 8, pp. 3055–3079. https://doi.org/10.3390/v6083055Generation of an Influenza A Virus Vector Expressing Biologically Active Human Interleukin-2 from the NS Gene Segment / C. Kittel [et al.] // J. Virol. – 2005. – Vol. 79, N 16. – P. 10672–10677. https://doi.org/10.1128/jvi.79.16.10672-10677.2005Kittel C., Ferko B., Kurz M., Voglauer R., Sereinig S., Romanova J., Stiegler G., Katinger H., Egorov A. Generation of an Influenza A Virus Vector Expressing Biologically Active Human Interleukin-2 from the NS Gene Segment. Journal of Virology, 2005, vol. 79, no. 16, pp. 10672–10677. https://doi.org/10.1128/jvi.79.16.10672-10677.2005Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60 / H. Jin [et al.] // Virology. – 2003. – Vol. 306, N 1. – P. 18–24. https://doi.org/10.1016/s0042-6822(02)00035-1Jin H., Lu B., Zhou H., Ma Ch., Zhao J., Yang Ch.-F., Kemble G., Greenberg H. Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. Virology, 2003, vol. 306, no. 1, pp. 18–24. https://doi.org/10.1016/s0042-6822(02)00035-1Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nef-specific systemic and mucosal immune responses in mice / B. Ferko [et al.] // Virology. – 2001. – Vol. 75, N 19. – P. 8899–8908. https://doi.org/10.1128/jvi.75.19.8899-8908.2001Ferko B., Stasakova J., Sereinig S., Romanova J., Katinger D., Niebler B., Katinger H., Egorov A. Hyperattenuated recombinant influenza A virus nonstructural-protein-encoding vectors induce human immunodeficiency virus type 1 Nefspecific systemic and mucosal immune responses in mice. Virology, 2001, vol. 75, no. 19, pp. 8899–8908. https://doi.org/101128/jvi.75.19.8899-8908.2001Intranasal inoculation of a recombinant influenza virus containing exogenous nucleotides in the NS segment induces mucosal immune response against the exogenous gene product in mice / N. Takasuka [et al.] // Vaccine. – 2002. – Vol. 20, N 11–12. – P. 1579–1585. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(01)00491-1Takasuka N., Enami M., Itamura S., Takemori T. Intranasal inoculation of a recombinant influenza virus containing exogenous nucleotides in the NS segment induces mucosal immune response against the exogenous gene product in mice. Vaccine, 2002, vol. 20, no. 11–12, pp. 1579–1585. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(01)00491-1Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells / A. Egorov [et al.] // J. Virol. – 1998 – Vol. 72, N 8. – P. 6437–6441. https://doi.org/10.1128/JVI.72.8.6437-6441.1998Egorov A., Brandt S., Sereinig S., Romanova J., Ferko B., Katinger D., Grassauer A., Alexandrova G., Katinger H., Muster T. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. Journal of Virology, 1998, vol. 72, no. 8, pp. 6437–6441 https://doi.org/10.1128/JVI.72.8.6437-6441.1998Influenza Viral Vectors Expressing Two Kinds of HA Proteins as Bivalent Vaccine Against Highly Pathogenic Avian Influenza Viruses of Clade 2.3.4.4 H5 and H7N9 / J. Li [et al.] // Front Microbiol. – 2018. – Vol. 9. – Art. 604. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00604Li J., Hou G., Wang Y., Wang S., Peng C., Yu X., Jiang W. Influenza Viral Vectors Expressing Two Kinds of HA Proteins as Bivalent Vaccine Against Highly Pathogenic Avian Influenza Viruses of Clade 2.3.4.4 H5 and H7N9. Frontiers in Microbiology, 2018, vol. 9, art. 604. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00604Король, О. И. Туберкулез у детей и возможности его предупреждения / О. И. Король // Туберкулез: проблемы диагностики, лечения и профилактики: тр. Всерос. науч.-практ. конф., 13–14 нояб. 2003 г. / под ред. Ю. Н. Левашева. – СПб., 2003. – С. 100–104.Korol’ O. I. Tuberculosis in children and the possibilities of its prevention. Tuberkulez. Problemy diagnostiki, lecheniya i profilaktiki: trudy Vserossiiskoi nauchno-prakticheskoi konferentsii, 13–14 noyabrya 2003 goda [Tuberculosis. Problems of diagnostics, treatment and prevention: proceedings of the All-Russian scientific and practical conference, November 13–14, 2003]. Saint Petersburg, 2003, pp. 100–104 (in Russian).Медуницын, Н. В. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней : учеб. пособие / Н. В. Медуницын, В. И. Покровский. – М. : Геотар-Медиа, 2005. – 528 с.Medunitsyn N. V., Pokrovskii V. I. Fundamentals of immunoprophylaxis and immunotherapy of infectious diseases. Study guide. Moscow, Geotar-Media Publ., 2005. 528 p. (in Russian).Identification of Novel Mycobacterium bovis Antigens by Dissection of Crude Protein Fractions / V. Meike [et al.] // Clin. Vaccine Immunol. – 2009. – Vol. 16, N 9. – P. 1352–1359. https://doi.org/10.1128/cvi.00211-09Meikle V., Alito A., Llera A. S., Gioffré A., Peralta A., Buddle B. M., Cataldi A. Identification of Novel Mycobacterium bovis Antigens by Dissection of Crude Protein Fractions. Clinical and Vaccine Immunology, 2009, vol. 16, no. 9, pp. 1352– 1359. https://doi.org/10.1128/cvi.00211-09Pollock, J. M. The potential of the ESAT-6 antigen secreted by virulent mycobacteria for specific diagnosis of tuberculosis / J. M. Pollock, P. Andersen // J. Infect. Dis. – 1997. – Vol. 175, N 5. – P. 1251–1254. https://doi.org/10.1086/593686Pollock J. M., Andersen P. The potential of the ESAT-6 antigen secreted by virulent mycobacteria for specific diagnosis of tuberculosis. Journal of Infectious Diseases, 1997, vol. 175, no. 5, pp. 1251–1254. https://doi.org/10.1086/593686Immune responses and protective efficacy of the gene vaccine expressing Ag85B and ESAT6 fusion protein from Mycobacterium tuberculosis / Sh. Chang-hong [et al.] // DNA Cell Biol. – 2008. – Vol. 27, N 4. – P. 199–207. https://doi.org/10.1089/dna.2007.0648Chang-hong Sh., Wang X.-W., Zhang H., Zhang T.-F., Wang L-M., Xu Zh.-K. Immune responses and protective efficacy of the gene vaccine expressing Ag85B and ESAT6 fusion protein from Mycobacterium tuberculosis. DNA and Cell Biology, 2008, vol. 27, no. 4, pp. 199–207. https://doi.org/10.1089/dna.2007.0648

The authors declare that there are no conflicts of interest present.