vestibИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Biological Series1029-89402524-230XThe Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1029-8940-2020-65-2-239-244vestib-673Research ArticleСтатьиСоздание штамма – продуцента бактериальной пуриннуклеозидфосфорилазы, слитой с человеческим аннексином А5Creation of strain – producer of bacterial purine nucleoside phosphorylase fused with human annexin A5БулатовскийА. Б.BulatovskiA. B.

Булатовский Алексей Борисович – мл. науч. сотрудник

ул. Купревича, 2, 220141, г. Минск

Аleksei B. Bulatovski – Junior researcher

2, Kuprevich Str., 220141, Minsk

a.bulatovski@yandex.ruЗинченкоА. И.ZinchenkoA. I.

Зинченко Анатолий Иванович – член-корреспондент, д-р биол. наук, профессор, заведующий лабораторией

ул. Купревича, 2, 220141, г. Минск

Anatoliy I. Zinchenko – Corresponding Member, D. Sc. (Biol.), Professor, Head of the Laboratory

2, Kuprevich Str., 220141, Minsk

zinch@mbio.bas-net.byИнститут микробиологии НАН БеларусиInstitute of Microbiology of the National Academy of Sciences of Belarus202016052020652239244Copyright © Булатовский А.Б., Зинченко А.И., 20202020Булатовский А.Б., Зинченко А.И.Bulatovski A.B., Zinchenko A.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestibio.belnauka.by/jour/article/view/673

Бактериальная пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФаза), в отличие от ПНФазы млекопитающих, способна подвергать фосфоролитическому расщеплению аденозин и его производные с образованием свободных азотистых оснований. Это позволяет использовать ПНФазу бактерий (при условии решения проблемы доставки этого фермента или его гена в клетки-мишени) в качестве пролекарственной терапии рака. Кроме того, ПНФаза в ложе опухоли может разрушать внеклеточный аденозин, который, как известно, защищает раковые клетки от противоопухолевого иммунитета.

В результате проведенного исследования сконструирован новый штамм Escherichia coli, продуцирующий химерный белок, молекула которого состоит из гомологичной ПНФазы, слитой с человеческим аннексином А5 – белком, проявляющим сродство к раковым клеткам. Продуцирующая способность штамма – продуцента химерного белка «Аннексин-ПНФаза» в отношении ПНФазы, рассчитанная по результатам реакции фосфоролиза инозина, составила 10 200 ед/мл культуральной жидкости. Полученный штамм предназначен для создания технологии получения новых противоопухолевых препаратов.

It is known that bacterial purine nucleoside phosphorylase (PNPase), unlike mammalian PNPase, is capable of phosphorolytic cleavage of adenosine and its derivatives to form free nitrogen bases. This makes it possible to use bacterial PNPase (provided the problem of delivering this enzyme or its gene to target cells is solved) as a prodrug therapy for cancer. In addition, PNPase in a tumor bed can destroy extracellular adenosine, which is known to protect cancer cells from antitumor immunity.

As a result of the study, a new strain of Escherichia coli was constructed, producing a chimeric protein whose molecule consists of a homologous PNPase fused to human annexin A5, a protein showing affinity for cancer cells.

The production capacity of the producer strain of the chimeric protein “Annexin-PNPase” with respect to PNPase calculated from the results of the inosine phosphorolysis reaction, was 10,200 units/ml of culture liquid. The obtained strain is intended for creation of a technology for obtaining new antitumor preparations.

рекомбинантный штаммхимерный белокчеловеческий аннексин А5пуриннуклеозидфосфорилазаEscherichia colirecombinant strainfusion proteinhuman annexin A5purine nucleoside phosphorylaseEscherichia coliРабота выполнена в рамках задания 3.32 Государственной программы научных исследований «Микробные биотехнологии», 2016–2020 гг.The work was supported by the grant 3.32 from the Belarus State Research Program “Microbial Biotechnologies”, 2016–2020.ReferencesExpression, purification, and characterization of recombinant purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli / J. Lee [et al.] // Protein Expr. Purif. – 2001. – Vol. 22, N 2. – Р. 180–188. https://doi.org/10.1006/prep.2001.1437Lee J., Filosa S., Bonvin J., Guyon S., Aponte R. A., Turnbull J. L. Expression, purification, and characterization of recombinant purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 2001, vol. 22, no. 2, pp. 180–188. https://doi.org/10.1006/prep.2001.1437Portsmouth, D. Suicide genes for cancer therapy / D. Portsmouth, J. Hlavaty, M. Renner // Mol. Aspects Med. – 2007. – Vol. 28, N 1. – P. 4–41. https://doi.org/10.1016/j.mam.2006.12.001Portsmouth D., Hlavaty J., Renner M. Suicide genes for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine, 2007, vol. 28, no. 1, pp. 4–41. https://doi.org/10.1016/j.mam.2006.12.001Krais, J. J. Purine nucleoside phosphorylase targeted bу Annexin V to breast cancer vasculature for enzyme prodrug therapy / J. J. Krais, О. De Crescenzo, R. G. Harrison // PLoS ONE. – 2013. – Vol. 8, N 10. – P. е76403. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076403Krais J. J., De Crescenzo О., Harrison R. G. Purine nucleoside phosphorylase targeted bу Annexin V to breast cancer vasculature for enzyme prodrug therapy. PLoS ONE, 2013, vol. 8, no. 10, p. е76403. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076403In vivo gene therapy of cancer with Е. coli purine nucleoside phosphorylase / W. В. Parker [et аl.] // Hum. Gene Ther. – 1997. – Vol. 8, N 14. – Р. 1637–1644. https://doi.org/10.1089/hum.1997.8.14-1637Parker W. В., King S. A., Allan P. W., Bennett L. L. Jr, Secrist J. A. 3rd, Montgomery J. A. [et al.]. In vivo gene therapy of cancer with Е. coli purine nucleoside phosphorylase. Human Gene Therapy, 1997, vol. 8, no. 14, pp. 1637–1644. https://doi.org/10.1089/hum.1997.8.14-1637Синтез флударабин-5′-монофосфата с использованием бактериальных рекомбинантных ферментов / А. И. Береснев [и др.] // Вес. Нац. акад. навук Беларусі. Сер. бiял. навук. – 2017. – Т. 62, № 1. – С. 7–15.Beresnev А. I., Rymko А. N., Eroshevskaya L. А., Kvach S. V., Kvasyuk Е. I., Zinchenko А. I. Synthesis of fludarabine 5ʹ-monophosphate using bacterial recombinant enzymes. Vestsi Natsyyanal’nai akademii navuk Belarusi. Seryya biyalagichnykh navuk = Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus. Biological series, 2017, vol. 62, no. 1, рр. 7–15 (in Russian).In search of a novel target – phosphatidylserine exposed by non-apoptotic tumor cells and metastases of malignancies with poor treatment efficacy / S. Riedl [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. Biomembranes. – 2011. – Vol. 1808, N 11. – P. 2638– 2645. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2011.07.026Riedl S. I., Rinner B., Asslaber M., Schaider H., Walzer S., Novak A., Lohner K., Zweytick D. In search of a novel target – phosphatidylserine exposed by non-apoptotic tumor cells and metastases of malignancies with poor treatment efficacy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes, 2011, vol. 1808, no. 11, pp. 2638–2645. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2011.07.026Sharma, B. Phosphatidylserine: a cancer cell targeting biomarker / B. Sharma, S. S. Kanwar // Semin. Cancer Biol. – 2018. – Vol. 52, Pt. 1. – P. 17–25. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2017.08.012Sharma B., Kanwar S. S. Phosphatidylserine: a cancer cell targeting biomarker. Seminars in Cancer Biology, 2017, vol. 52, pt. 1, pp. 17–25. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2017.08.012Sambrook, J. F. Molecular cloning: a laboratory manual / J. F. Sambrook, D. W. Russell. – 3rd ed. – New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. – 2100 p.Sambrook J. F., Russell D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press Publ., 2001. 2100 p.Quan, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways / J. Quan, J. Tian // PLoS ONE. – 2009. – Vol. 4, N 7. – P. e6441. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006441Quan J., Tian J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways. PLoS ONE, 2009, vol. 4, no. 7, p. e6441. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006441Walker, J. M. The protein protocol handbook / J. M. Walker. – 2nd ed. – Totowa : Humana Press, 2002. – 15 p.Walker J. M. The protein protocol handbook. 2nd ed. Totowa, Humana Press Publ., 2002. 15 p.Vaupel, P. Hypoxia-driven adenosine accumulation: a crucial microenvironmental factor promoting tumor progression / P. Vaupel, A. Mayer // Advances in Experimental Medicine and Biology / ed. : C. E. Elwell, T. S. Leung, D. K. Harrison. – New York, 2016. – Vol. 876 : Oxygen Transport to Tissue. – P. 177–183.Vaupel P., Mayer A. Hypoxia-driven adenosine accumulation: a crucial microenvironmental factor promoting tumor progression. Advances in Experimental Medicine and Biology. Vol. 876. Oxygen Transport to Tissue. New York, 2016, pp. 177–183. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3023-4_22Зинченко, А. И. Аденозин как потенциальная мишень для биотерапии рака / А. И. Зинченко // Вес. Нац. акад. навук Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2016. – Т. 61, № 4. – С. 118–128.Zinchenko A. I. Adenosine as а potential target for cancer biotherapy. Vestsi Natsyyanal’nai akademii navuk Belarusi. Seryya biyalagichnykh navuk = Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus. Biological series, 2016, vol. 61, no. 4, рр. 118–128 (in Russian).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.