vestibИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, Biological Series1029-89402524-230XThe Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1029-8940-2026-71-4-332-343vestib-1035Research ArticleСтатьиАнализ транскриптома мононуклеарных клеток периферической крови у пациентов с состоянием после COVID-19 на основе данных нанопорового секвенированияPBMC transcriptome analysis in long COVID patients based on nanopore sequencing datahttps://orcid.org/0000-0002-6725-5353ШафоростА. С.ShaforostA. S.

Шафорост Александр Сергеевич – ст. науч. сотрудник

ул. Ланге, 5, 246000, г. Гомель 

Alexander S. Shaforost – Senior Researcher 

5, Lange Str., 246000, Gomel 

asofocl@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9435-6109ВоропаевЕ. В.VoropaevE. V.

Воропаев Евгений Викторович – канд. мед. наук, доцент, проректор по научной работе

ул. Ланге, 5, 246000, г. Гомель 

Evgenii V. Voropaev – Ph. D. (Med.), Associate Professor, Vice-Rector for Research

5, Lange Str., 246000, Gomel 

voropaev.evgenii@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-1706-0144ГалиновскаяН. В.HalinouskayaN. V.

Галиновская Наталья Викторовна – д-р мед. наук, профессор, декан

ул. Ланге, 5, 246000, г. Гомель 

Natallia V. Halinouskaya – D. Sc. (Med.), Professor, Dean

5, Lange Str., 246000, Gomel 

halinouskaya@gsmu.byhttps://orcid.org/0000-0001-9542-3791ЗятьковА. А.ZiatskovA. A.

Зятьков Алексей Александрович – ст. науч. сотрудник

ул. Ланге, 5, 246000, г. Гомель 

 Aliaksei A. Ziatskov – Senior Researcher 

5, Lange Str., 246000, Gomel 

ziatskovaa@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-1931-4224ОсипкинаО. В.OsipkinaO. V.

Осипкина Ольга Викторовна – заведующий лабораторией

ул. Ланге, 5, 246000, г. Гомель 

Olga V. Osipkina – Head of the Laboratory 

5, Lange Str., 246000, Gomel 

olga.osipkina@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4360-4341БарбаровичА. А.BarbarovichA. A.

Барбарович Анастасия Александровна – ассистент кафедры

ул. Ланге, 5, 246000, г. Гомель 

 

5, Lange Str., 246000, Gomel 

Feniks-1342@mail.ruГомельский государственный медицинский университетБеларусьGomel State Medical UniversityBelarus202611112026714332342Copyright © Шафорост А.С., Воропаев Е.В., Галиновская Н.В., Зятьков А.А., Осипкина О.В., Барбарович А.А., 20262026Шафорост А.С., Воропаев Е.В., Галиновская Н.В., Зятьков А.А., Осипкина О.В., Барбарович А.А.Shaforost A.S., Voropaev E.V., Halinouskaya N.V., Ziatskov A.A., Osipkina O.V., Barbarovich A.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestibio.belnauka.by/jour/article/view/1035

По данным ВОЗ, вероятность развития осложнений после коронавирусной инфекции составляет 10–20 %. Состояние после COVID-19 снижает качество жизни пациентов, важную роль в его развитии играет изменение реактивности иммунной системы. Пилотное исследование транскриптома мононуклеарных клеток периферической крови (МНК) пациентов с состоянием после COVID-19 с применением нанопорового секвенирования позволяет получить предварительные данные для характеристики функционального статуса МНК и выявления потенциальных мишеней для разработки новых эффективных средств персонализированной терапии данного заболевания.

В исследовании участвовали 5 пациентов с симптомами состояния после COVID-19 длительностью 3–6 месяцев. В качестве контроля использовали данные секвенирования транскриптома МНК 6 здоровых добровольцев. Секвенирование транскриптома производили на секвенаторе PromethION 2 Solo (ячейки FLO-PRO114M (R10.4.1), применяли набор для пробоподготовки Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24). Анализ дифференциальной экспрессии (ДЭ) генов осуществляли с помощью DESeq2. Для анализа обогащения в терминах генной онтологии (Gene Ontology, GO) использовали R-пакет clusterProfiler (4.14.6). Для определения семантического сходства терминов GO – REViGO, построение функциональных сетей в виде сети GO-терминов (биологические процессы) выполняли в CytoScape 3.10.4.

Выявлено 41 164 экспрессируемых гена, в том числе 5 309 генов имели значимо различающуюся экспрессию (log₂FoldChange > |1|, padj < 0,05); 2 102 гена ассоциированы с 163 биологическими процессами в терминах GO: 146 из них характеризовались снижением экспрессии генов, 17 – повышенной. Наблюдаются изменения, ассоциированные со снижением показателей, характерных для пролиферативной активности МНК, ослаблением интенсивности процессов, связанных с врожденным и адаптивным иммунитетом, и перестройкой метаболических процессов в сторону стабилизации состояния клеток на фоне активации биогенеза рибосом, окислительного фосфорилирования и подавления протеолиза.

According to the WHO, the risk of developing complications after SARS-CoV-2 infection is 10–20 %. Long COVID leads to a decrease in patients’ quality of life, and changes in immune system reactivity play a significant role in this. This pilot study of the PBMC transcriptome in patients with long COVID using nanopore sequencing aims to provide preliminary data on the functional status of PBMC and identify potential targets for the development of new effective personalized therapies for this disease.

The transcriptome analysis protocol included RNA extraction (GeneJET RNA Purification Kit), DNA removal (DNase I), double-stranded cDNA synthesis (Mint kit-2), sequencing library preparation (SQK-NBD114.24), nanopore sequencing (PromethION 2 Solo, FLO-PRO114M (R10.4.1) cells), basecalling (Dorado), read quality assessment (nanoQC/FastQC), adapter trimming and length/quality filtering (Cutadapt (5.2)/seqkit(2.12.0)), and data preparation for differential gene expression assessment (minimap2 in map-ont mode, samtools (1.10.2), Picard tools (CollectRnaSeqMetrics), featureCounts (2.1.1), biomaRt (2.62.1)), differential expression analysis (RStudio 2025.05.0 Build 418, DESeq2 (1.46.0), pheatmap (1.0.13), dplyr (1.1.4), RColorBrewer (1.1.-3), ggplot2 (3.5.2), ggrepel (0.9.6), apeglm (1.28.0) packages), GSEA-analysis (clusterProfiler (4.14.6), org.Hs.eg.db (3.20.0), enrichplot (1.26.6), DOSE (4.0.1), igraph (2.2.1)), semantic similarity of GO terms (biological process (BP) analysis (REViGO)), BP functional network creation (Cytoscape 3.10.4).

A pilot study of the peripheral blood leukocyte transcriptome in patients with long COVID using nanopore sequencing revealed significant differences in gene expression (n = 2,102) involved in 163 biological processes. Analysis of these changes in activity indicated a significant decrease in the overall functional activity of leukocytes, accompanied by a decrease in proliferative activity, weakening of innate and adaptive immunity, and a restructuring of metabolic processes toward cellular stabilization against the background of increased ribosome biogenesis, activation of oxidative phosphorylation and suppression of proteolysis.

состояние после COVID-19транскриптоммононуклеарные клетки периферической крови человекананопоровое секвенированиедифференциальная экспрессия геновбиологический процесссистемный анализlong COVID syndrometranscriptomehuman leukocytesnanopore sequencingdifferential gene expressionbiological processsystemic analysisReferencesMolecular and biological characterization of messenger RNA / F. Gros, W. Gilbert, H. H. Hiatt [et al.] // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. – 1961. – Vol. 26. – P. 111–132. https://doi.org/10.1101/sqb.1961.026.01.016Gros F., Gilbert W., Hiatt H. H., Attardi G., Spahr P. F., Watson J. D. Molecular and biological characterization of messenger RNA. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1961, vol. 26, pp. 111–132. https://doi.org/10.1101/sqb.1961.026.01.016McGettigan, P. A. Transcriptomics in the RNA-seq era / P. A. McGettigan // Current Opinion in Chemical Biology. – 2013. – Vol. 17, N 1. – P. 4–11. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2012.12.008McGettigan P. A. Transcriptomics in the RNA-seq era. Current Opinion in Chemical Biology, 2013, vol. 17, no. 1, pp. 4–11. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2012.12.008Serial Analysis of Gene Expression / V. E. Velculescu, L. Zhang, B. Vogelstein, K. Kinzler // Science. – 1995. – Vol. 270, N 5235. – P. 484–487. https://doi.org/10.1126/science.270.5235.484Velculescu V. E., Zhang L., Vogelstein B., Kinzler K. W. Serial Analysis of Gene Expression. Science, 1995, vol. 270, no. 5235, pp. 484–487. https://doi.org/10.1126/science.270.5235.484Niemitz, E. The microarray revolution / E. Niemitz // Nature Reviews Genetics. – 2007. – Vol. 8, Suppl. 1. – P. S15. https://doi.org/10.1038/nrg2259Niemitz E. The microarray revolution. Nature Reviews Genetics, 2007, vol. 8, suppl. 1, p. S15. https://doi.org/10.1038/nrg2259Comparison of Next-Generation Sequencing Systems / L. Liu, Y. Li, S. Li [et al.] // Journal of Biomedicine and Biotechnology. – 2012. – Vol. 2012. – Art. 251364. https://doi.org/10.1155/2012/251364Liu L., Li Y., Li S., Hu N., He Y., Pong R., Lin D., Lu L., Law M. Comparison of Next-Generation Sequencing Systems. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, vol. 2012, art. 251364. https://doi.org/10.1155/2012/251364Long-read RNA sequencing: A transformative technology for exploring transcriptome complexity in human diseases / I. H. Ament, N. DeBruyne, F. Wang, L. Lin // Molecular Therapy. – 2025. – Vol. 33, N 3. – P. 883–894. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2024.11.025Ament I. H., DeBruyne N., Wang F., Lin L. Long-read RNA sequencing: A transformative technology for exploring transcriptome complexity in human diseases. Molecular Therapy, 2025, vol. 33, no. 3, pp. 883–894. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2024.11.025A transcriptomics approach to expand therapeutic options and optimize clinical trials in oncology / V. Lazar, B. Zhang, S. Magidi [et al.] // Therapeutic Advances in Medical Oncology. – 2023. – Vol. 15. – Art. 17588359231156382. https://doi.org/10.1177/17588359231156382Lazar V., Zhang B., Magidi S., Le Tourneau C., Raymond E., Ducreux M. [et al.]. A transcriptomics approach to expand therapeutic options and optimize clinical trials in oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology, 2023, vol. 15, art. 17588359231156382. https://doi.org/10.1177/17588359231156382Clinical applications of and molecular insights from RNA sequencing in a rare disease cohort / J. C. Stark, N. Pipko, Y. Liang [et al.] // Genome Medicine. – 2025. – Vol. 17, N 1. – Art. 72. https://doi.org/10.1186/s13073–025–01494–wStark J. C., Pipko N., Liang Y., Szuto A., Tsoi C. T., Dickson M. A. [et al.]. Clinical applications of and molecular insights from RNA sequencing in a rare disease cohort. Genome Medicine, 2025, vol. 17, no. 1, art. 72. https://doi.org/10.1186/s13073–025–01494–wPersonalized medicine for rare neurogenetic disorders: can we make it happen? / A. M. van Eeghen, H. Bruining, N. I. Wolf [et al.] // Cold Spring Harbor molecular case studies. – 2022. – Vol. 8, N 2. – Art. a006200. https://doi.org/10.1101/mcs.a006200van Eeghen A. M., Bruining H., Wolf N. I., Bergen A. A., Houtkooper R. H., van Haelst M. M., van Karnebeek C. D. Personalized medicine for rare neurogenetic disorders: can we make it happen? Cold Spring Harbor Molecular Case Studies, 2022, vol. 8, no. 2, art. a006200. https://doi.org/10.1101/mcs.a006200Спектр нейропсихологических нарушений у пациентов с постковидным синдромом / Н. В. Галиновская, И. О. Стома, Е. В. Воропаев [и др.] // Неврология и Нейрохирургия. Восточная Европа. – 2024. – Т. 14, № 3. – С. 323–334.Galinovskaya N. V., Stoma I. O., Voropaev E. V., Barbarovich A. A., Bobovich N. V., Osipkina O. V. Spectrum of Neuropsychological Abnormalities in Patients with Post-COVID Syndrome. Nevrologiya i neirokhirurgiya. Vostochnaya Evropa = Neurology and Neurosurgery Eastern Europe, 2024, vol. 14, no. 3, pp. 323–334 (in Russian).Transcriptomic Profiling of Long COVID-19 in Patients with Interstitial Lung Disease Reveals Dysregulation of Mitochondrial Oxidative Phosphorylation / K. A. Aracena, G. C. Nwankwo, C. T. Lee [et al.] // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. – 2025. – Vol. 73, N 4. – P. 634–637. https://doi.org/10.1165/rcmb.2024-0595leAracena К. A., Nwankwo G. C., Lee C. T., Karnik R., Ventura I., Douglas D., Udofia I., Chen M., Chelala L., Im H. K., Strek M. E. Transcriptomic Profiling of Long COVID-19 in Patients with Interstitial Lung Disease Reveals Dysregulation of Mitochondrial Oxidative Phosphorylation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 2025, vol. 73, no. 4, pp. 634–637. https://doi.org/10.1165/rcmb.2024–0595LETranscriptome analysis of classical blood cells reveals downregulation of pro-inflammatory genes in the classical monocytes of long COVID patients / F. Fricke, F. Mai, C. Wossidlo [et al.] // Frontiers in Immunology. – 2025. – Vol. 16. – Art. 1710783. https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1710783Fricke F., Mai F., Wossidlo C., Steinbeck F., Bergmann-Ewert W., Kordt M., Kraft K., Műller B., Reisinger E. C., Műller-Hilke B. Transcriptome analysis of classical blood cells reveals downregulation of pro-inflammatory genes in the classical monocytes of long COVID patients. Frontiers in Immunology, 2025, vol. 16, art. 1710783. https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1710783Bulk RNA sequencing for analysis of post COVID-19 condition in adolescents and young adults / S. L. Sommen, Z. Zhao, S. Segtnan [et al.] // Journal of Translational Medicine. – 2024. – Vol. 22, N 1. – Art. 312. https://doi.org/10.1186/s12967-024-05117-7Sommen S. L., Zhao Z., Segtnan S., Stiansen-Sonerud T., Selvakumar J., Beier Havdal L., Gjerstad J., Wyller V. B. B., Lund Berven L. Bulk RNA sequencing for analysis of post COVID–19 condition in adolescents and young adults. Journal of Translational Medicine, 2024, vol. 22, no. 1, art. 312. https://doi.org/10.1186/s12967-024-05117-7Towards understanding post-COVID-19 condition: A systematic meta-analysis of transcriptomic alterations with sex-specific insights / E. C. Rusu, P. Monfor-Lanzas, L. Bertran [et al.] // Computers in Biology and Medicine. – 2024. – Vol. 175. – Art. 108507. https://doi.org/10.1016/j.compbiomed.2024.108507Rusu E. C., Monfor-Lanzas P., Bertran L., Barrientos-Riosalido A., Solé E., Mahmoudian R., Aguilar C., Briansó S., Mohamed F., Garcia S., Camaron J., Auguet T. Towards understanding post-COVID-19 condition: A systematic meta-analysis of transcriptomic alterations with sex-specific insights. Computers in Biology and Medicine, 2024, vol. 175, art. 108507. https://doi.org/10.1016/j.compbiomed.2024.108507Comprehensive transcriptome assessment in PBMCs of post-COVID patients at a median follow-up of 28 months after a mild COVID infection reveals upregulation of JAK/STAT signaling and a prolonged immune response / S. Fineschi, J. Klar, J. R. Lopez Egido [et al.] // Frontiers in Immunology. – 2025. – Vol. 16. – Art. 1589589. https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1589589Fineschi S., Klar J., Lopez Egido J. R., Schuster J., Bergquist J., Kaden R., Dahl N. Comprehensive transcriptome assessment in PBMCs of post-COVID patients at a median follow-up of 28 months after a mild COVID infection reveals upregulation of JAK/STAT signaling and a prolonged immune response. Frontiers in Immunology, 2025, vol. 16, art. 1589589. https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1589589

The authors declare that there are no conflicts of interest present.